microRNA-21介导的雪旺细胞自噬在周围神经修复中的作用及机制研究

This project by schwann cells after nerve injury occurred autophagy as the breakthrough point, based on the research of small rnas (mirna) in the process of nerve repair mechanism research, observe the adjustment of mirnas - 21 on schwann cell autophagy. Application of confocal fluorescence technology and transmission electron microscopy (sem), protein quantitative and neural tracer technology and neural function evaluation methods, explore the affection of the BCL - 2 on schwann cells as micrornas - 21 target genes, the molecular mechanisms of autophagy,via BCL-2 /Beclin 1-PI3K. And implante transfection micrornas - 21 schwann cells damaged nerve of the rat to neural function assessment, and detect injuries focal schwann cell proliferation, signal molecule activity related to nerve regeneration, growth of axons. This project Aims to explore the process of nerve injury moderate schwann cell after transcription regulation in cells involved in the mechanism of action of schwann cell autophagy, nerve injury regeneration theory, offers a new therapy for treatment of nerve damage train of thought and theory basis.

本项目以神经损伤后雪旺细胞发生自噬为切入点，在课题组前期对小分子RNA（microRNA）在神经修复过程中的作用机制的研究基础上，观察microRNA-21对雪旺细胞自噬的调节作用。应用荧光共聚焦技术、透射电镜、蛋白定量、神经示踪等技术及神经功能评估方法，探究BCL-2作为microRNA-21的靶基因，通过BCL-2 /Beclin 1-PI3K途径影响雪旺细胞自噬的分子机制，并在植入转染microRNA-21雪旺细胞的受损神经进行大鼠神经功能评估，以及检测损伤灶雪旺细胞增殖情况、神经再生相关信号分子活性、轴突生长等情况在修复过程中的改变。本项目旨在探讨在神经损伤过程中雪旺细胞内转录后用调控参与雪旺细胞自噬 的作用机制，丰富神经损伤再生理论，为治疗神经损伤提供新的治疗思路与理论依据。

项目背景：周围神经损伤后雪旺细胞可通过自噬作用参与神经损伤的修复。本项目研究糖氧剥夺（OGD）处理后雪旺细胞microRNA-21（miR-21）的表达变化情况，以及过表达miR-21 是否通过靶向抑制PDCD4 进而影响其下游JNK/BCL-2/Beclin-1 通路调节自噬水平减少雪旺细胞凋亡。.研究内容：利用定量PCR（qRT-PCR）检测神经损伤模型及OGD 条件下雪旺细胞miR-21的表达量的变化。进而用miR-21 mimic 或negative control（NC）转染RSC96 细胞，建立过表达miR-21 雪旺细胞以及对照组模型。利用CCK-8 检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡情况。利用共聚焦和透射电镜技术探究miR-21 是否影响OGD 下雪旺细胞自噬；运用生物信息学技术预测miR-21 的候选靶基因，运用荧光素酶报告基因、western blot和qRT-PCR 对候选靶基因进行验证，根据靶基因的功能特点分析miR-21 在OGD 环境下对雪旺细胞的调控作用；利用Western blot 技术检测miR-21 对程序性死亡蛋白（PDCD4）、应激活化蛋白激酶（JNK）、人滤泡性B 细胞淋巴瘤原癌基因（Bcl-2）以及自噬相关蛋白LC3 II（Atg8-II），酵母ATG6 同源物（Beclin-1）表达水平的影响。.研究结果及关键数据： OGD 条件下雪旺细胞中miR-21 的表达量明显升高（ p<0.05 ）。过表达miR-21 可以增加细胞自噬水平并减少OGD 诱导的细胞凋亡( p<0.05 )，生物信息学预测软件分析miR-21 的潜在靶基因，双荧光素酶报告基因、qRT-PCR 和Westernblot证实，miR-21 通过与PDCD4 的3'-UTR 结合并引起PDCD4 mRNA 降解和翻译抑制；过表达miR-21 后程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4）表达下降而其下游p-JNK、p-Bcl-2、LC3II/I、Beclin-1 蛋白的表达增加(p<0.01)。而过表达PDCD4 则逆转了miR-21 雪旺细胞的自噬过程增加了雪旺细胞的凋亡。.科学意义： miR-21 通过靶向抑制PDCD4 并影响其下游JNK/BCL-2/Beclin-1信号通路进而提高自噬水平，减少OGD 诱导的雪旺细胞凋亡，提高雪旺细胞的抗凋亡能力。