高毒力肺炎克雷伯菌耐药形成发展的分子机制和微进化研究

Multidrug resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae (hvKP) is an emerging “superbug” in clinical settings. However, the risk and molecular mechanism of antimicrobial resistance development in hvKP remain unknown. Our previous study found that the carbapenem-resistant hvKP has emerged. To confirm the possibility, mechanisms and fitness costs of antimicrobial resistance, the hvKP clinical isolates with different susceptibility patterns in our previous study will be selected. The ability of hvKP to acquire resistance to β-lactams, tigecycline, and colistin will be investigated by experimental evolution study. The phenotypic characterization, virulence, fitness costs, and compensatory mechanism of conjugants and resistance mutants will be determined by growth rate curve, in-vitro and in-vivo competition growth experiments, and in-vivo virulence experiments. The evolution and functions of the important gene mutations will be studied by the whole genome sequencing, RNAseq, transcriptomics and proteinomics analysis. This study will clarify the molecular mechanism and fitness costs of antimicrobial resistance development in hvKP. This promising project will provide the evidence for control and treatment strategy of hypervirulent Klebsiella pneumoniae, and put forward innovative theory for development of novel antibiotics.

多重耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）是临床面临的一个新“超级挑战”，目前其耐药形成、发展的风险和趋势未明。我们前期研究发现，我国临床已出现对碳青霉烯类耐药的hvKP。为明确hvKP耐药形成机制和适应性代价，本项目拟对前期获得的不同药敏谱型的hvKP，采用实验进化学研究方法，通过外源导入耐药基因和体外耐药突变筛选两种途径，研究hvKP对β-内酰胺类、替加环素、黏菌素耐药发生的风险；采用生长速率法、稳定性、体外和体内竞争生长实验、体内毒力实验，研究不同耐药水平的接合子和突变子较亲体株的耐药表型、毒力变化、适应性代价及补偿机制；采用全基因组测序、RNAseq、转录组学和蛋白质组学分析，阐明hvKP耐药形成的分子进化轨迹、重要基因突变的累积过程及其功能。本研究将深入揭示hvKP耐药形成、发展的分子机制和适应性代价，预测耐药发生的风险，为hvKP的防控、用药策略和新药的研发提供重要科学依据。

多重耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）是临床面临的一个新“超级挑战”，目前其耐药形成、发展的风险和趋势未明。研究发现我国hvKP的流行率较高，呈地域分布特征。高粘液表型、rmpA基因、K1、K2和K20血清型与hvKP显著相关。ST23、ST268、ST375、ST412和ST660常见于hvKP，而ST11、ST15和ST37则常见于经典型肺炎克雷伯菌（cKP）。hvKP比cKP更易引起临床严重的感染，如肝脓肿、脓毒血症和侵袭性感染。肿瘤和糖尿病是hvKP感染的独立危险因素。虽然多重耐药与高毒力合并菌株的检出率不高，但我们发现12.6%的hvKP菌株产ESBL，以CTX-M型为主。基于SNP的进化树分析显示，MLST类型一致的菌株大部分聚集在一起，然而不同地点的菌株也有部分聚集在一起，提示可能存在地域间传播。此外，我们发现了一株我国临床分离的碳青霉烯类耐药高毒力菌株（K2型、ST65），该菌株对碳青霉烯类高水平耐药。同时，体内外毒力试验表明菌株的毒力为“+++”，耐受血清杀菌。随后我们进一步对全国19个地区56家中心分离的1052株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）进行毒力相关研究，结果显示2015和2017年期间，我国CR-hvKP的流行率显著上升，从2.0%上升到8.1%（p=0.0035），特别是存在于CRKP主要流行克隆产KPC-2 ST11克隆。与普通CRKP相比，高毒力菌株的生长曲线无明显差异（p=0.7028），表明KPC-2 ST11型CR-hvKP具有传播的潜在风险。此外，全基因组数据提示毒力和耐药质粒之间存在进化。同时，我们选择一株全敏感hvKP（ST23）和两株CR-hvKP（ST11），通过连续突变筛选，我们获得了hvKP和CR-hvKP对替加环素和粘菌素的耐药突变子。结果表明，高毒力菌株可在较短时间内获得替加环素/粘菌素耐药性，且获得粘菌素耐药的时间短于获得替加环素耐药时间。耐药突变子较亲体株适应性明显降低。全基因组测序结果显示，ramR（Ala173fs或Trp89Arg或Gln135*）、lon（Asn417Lys）、mgrB和fbpC突变可能是导致替加环素/粘菌素耐药及适应性变化的关键。本研究为hvKP的防控提供重要科学依据。