全局性负调控蛋白GlnR对短乳杆菌GAD调控机制的研究

谷氨酰胺合成酶（GS）是氮代谢调控中的关键酶，其活力受严格的调控，乳酸菌全局性转录调节子GlnR可结合到其靶基因的启动子保守区域，通过GlnR调控GS实施Gln转运及GS活性。我们已克隆、鉴定和测序了Lactobacillus brevis BS6的GlnR基因和谷氨酸脱羧酶（GAD）基因，初步证明GlnR对L. brevis BS6的GAD活性及γ-氨基丁酸（GABA）产量具有调控作用。本项目为继续研究L. brevis BS6的GlnR对GAD和GABA的调控作用，采用PCR介导的基因置换技术构建突变菌株和回补质粒，以检测glnR缺失或增加拷贝后可控制的GlnR表达量在不同氮源条件下对L. brevis BS6的GAD活性及GABA产量的调控作用，以探索全局性负调控蛋白GlnR对L. brevis BS6的gad转录调控的工作机制。

γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统的重要的抑制性神经递质，具有多种重要的生理功能。本实验室从传统泡菜分离得到四株产γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid ，GABA)的菌株，经16S rDNA鉴定，其中三株为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，另一株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。短乳杆菌是乳酸杆菌属的重要菌种，被广泛应用于食品和医药行业。.GlnR是氮代谢的一个全局转录调控蛋白，广泛存在于革兰氏阳性细菌中。目前发现的GlnR既有MerR家族，也有OmpR家族。针对可利用氮源的变化，GlnR可以抑制或激活氮代谢相关基因的表达。本研究主要以GABA最高产量的短乳杆菌BS6为研究对象，探讨全局性转录调节蛋白GlnR在短乳杆菌氮代谢调控中的功能及其与γ-氨基丁酸产量的相关性。.glnRA、amtB-glnK和 glnPQ三个操纵子在短乳杆菌中心氮代谢中起着至关重要的作用。提取短乳杆菌BS6的基因组DNA，以基因组DNA为模板，扩增得到GlnR全长编码基因及包含GlnR盒的glnRA，amtB-glnK，glnPQ 启动子序列。运用细菌单杂交的方法证明GlnR在细菌体内可与上述3个操纵子的启动子结合，从而初步验证全局性转录因子GlnR在短乳杆菌氮代谢调控中的重要作用。进一步通过荧光定量PCR实验，分析glnR及其调控基因在不同氮源浓度下的转录水平，结果表明，GlnR对三个操纵子的表达确实存在一定的抑制作用。.谷氨酸脱羧酶(GAD)催化L-谷氨酸形成GABA。分别采用Berthelot比色法和预染纸色谱法对4株短乳杆菌的GAD活性和GABA产量进行测定，结果显示GABA产量和GAD活性呈正相关性。利用Tail-PCR获得gadCB操纵子上游序列，并进一步通过RT-PCR实验确定短乳杆菌中gltX属于gadCB操纵子，最后获得的gadCB操纵子序列全长5663bp。通过设计简并引物进行PCR，结果表明短乳杆菌中不存在γ-氨基丁酸逆向转运蛋白GabT，从另一方面证明GAD在GABA产量调节中的重要作用。为了探究全局性转录调控蛋白GlnR对GABA产量的调控作用，我们构建了glnR基因打靶载体pUCnR。为下一步获得△glnR突变株，并从分子水平上阐明GlnR对GAD活性和GABA产量的调控作用奠定基础。