线粒体呼吸链相关基因Cox7a2调控睾丸Leydig细胞睾酮合成及机制试验研究

伴随年龄增长的睾酮水平降低，会导致中老年男性发生部分雄激素缺乏综合征，影响生活质量。睾酮合成能力降低的内在机制未被阐明，但线粒体等细胞器的代谢产物如氧活性物质（ROS）的蓄积被认为加重细胞的功能衰退。睾酮合成的关键蛋白和酶（StAR、p450SCC、3β-HSD）与线粒体关系密切。前期研究证实线粒体呼吸链相关基因Cox7a2在老年睾丸中高度表达，考虑到线粒体在睾酮合成的重要作用，线粒体呼吸链相关基因Cox7a2的差异表达特征对睾酮合成调控的影响值得高度关注。本研究拟构建Cox7a2融合蛋白，利用小鼠睾丸Leydig细胞系作为模型，运用荧光显微镜、细胞和分子生物学的技术研究Cox7a2对睾丸Leydig细胞睾酮分泌的影响，以及其间氧活性物质（ROS）、睾酮合成关键调节蛋白和酶StAR、p450SCC、3β-HSD变化，以期初步阐明线粒体相关基因Cox7a2调控睾酮合成的内在机制。

研究结果有以下几个创新性及突破点：(1)首次阐明了Cox7a2对睾酮合成的影响是通过StAR类固醇快速调节蛋白发挥调节作用。以原代睾丸Leydig细胞及TM3睾丸Leydig细胞为模型，利用荧光显微镜及线粒体细胞器染色技术明确了融合荧光蛋白Cox7a2的亚细胞定位。利用蛋白免疫印记、荧光显微镜、分子克隆等技术研究发现Cox7a2能通过抑制StAR的蛋白调控Leydig细胞睾酮合成，不影响P450SCC及3β-HSD的表达及活性，这一过程伴随ROS水平的升高，且抑制自噬信号关键蛋白P70S6K 磷酸化，导致自噬活化；(2)首次明确了Ras信号通路蛋白与Cox7a2 融合荧光蛋白的相互作用。搭建好分子生物学技术平台，利用分子克隆构建了Cox7a2以及信号转导通路的基因RAS、AKT、P70S6K等分子的YFP及GFP融合荧光蛋白表达载体，包括全长及缺失体，并利用荧光显微镜观察了融合荧光蛋白的共定位；研究了Ras及其突变体N17Ras和Cox7a2的共定位，明确了相关的信号作用靶点；(3)首次揭示了衰老Leydig细胞睾酮合成相关的自噬信号通路调控规律及表达特点：研究结果发现在衰老Leydig 细胞睾酮合成能力衰退过程中，自噬信号蛋白Beclin-1 及LC3 等表达降低，在组织层面，衰老的睾丸组织中自噬信号分子LC3蛋白表达降低，电镜显示自噬小体在老年大鼠睾丸Leydig细胞中明显减低，这些研究结果为迟发性睾丸睾酮合成功能衰退的分子机制研究奠定了实验及理论基础；(4)首次证明了自噬信号调控与迟发性Leydig 细胞睾酮合成功能降低密切关联，初步明确了自噬信号调控靶点及作用机制。在TM3睾丸Leydig细胞中，siRNA抑制Beclin-1自噬信号分子导致睾酮的合成受到抑制，细胞ROS水平升高，荧光显微镜观察到LC3表达降低。睾酮调控关键蛋白StAR表达降低，LH诱导的睾酮合成水平下降。. 本课题研究拓展了本领域的研究范畴，揭示了睾酮合成衰退过程中自噬信号调控的新规律，对于明确LOH的分子机制及指导临床诊疗提供了新思路。课题严格按照计划书执行，实现了预定研究目标，超额完成预定科研任务，共发表论文13篇，国际及国内学术会议交流论文5篇，出版专著1部（副主编），促进了青年科学基金项目负责人科研水平的大力提升，为后续纵深研究、承担面上项目打下坚实基础。