应用改性丝素蛋白共价枝接BMP-2寡肽促进脊柱融合的实验研究

Bone graft substitutes play important roles on spinal fusion, of which bone morphogenetic protein (BMP) and its carriers are the research focus. Collagen absorbed with rhBMP-2 used in anterior lumbar interbody fusion was already approved by FDA. However,the shorcomings including a short released time and a difficult controlling procedure remain. Aim to the above mention, BMP-2 encapsuled in silk fibroin microspheres was manufactured in our previous study.BMP was released persistently but with an irregular mode and a poor loading drug capacity. Thus, the modified side chain in silk fibroin combined with the functional domain in BMP are planed to reconstruct in order to releasing bioactive molecules. In the current study, amino acid series in core fuctional domain of BMP-2 is planning to construct by genetic engineering tecniques. Then the bioactive peptide of BMP-2 links to the silk fibroin devoided of P25 protein. The osteoinductive mechanism of bioactive oligopeptide and its capacity on spinal fusion are evaluated by RT-PCR, Western blot, images and biomechanics at levels of molecules, cells, tissues and animals. It will provide a new instruction to study the combination of BMP and carrier and bone grafts, if it develop succeedly.

植骨材料是脊柱融合成功与否的关键因素，其中骨形态发生蛋白（BMP）及其载体是目前研究的热点。由胶原蛋白吸附的rhBMP-2已被FDA批准应用于腰椎前路椎体间融合，但仍存在活性因子的释放时间短及难以调控等缺点。针对以上情况，我们前期利用丝素蛋白微球负载rhBMP-2，活性可持续维持，但不规律及负载药量欠佳。因此，我们设想通过修饰丝素蛋白的侧链后，与BMP的功能区结合，构建可持续诱导成骨的氨基酸多肽。为了验证这一假说，本项目利用基因重组技术合成BMP-2的核心功能区氨基酸序列，与去P25蛋白的丝素蛋白枝接聚合，采用生物分子学、RT-PCR、Western blot、影像学及生物力学等手段，从分子、细胞、组织及动物水平等层次，来探讨去P25蛋白的丝素蛋白共价枝接BMP-2多肽的促成骨机制，以及促进脊柱融合的能力。如果活性多肽研制成功，将为载体与BMP结合及植骨材料的研究提供新的思路。

脊柱融合术是治疗腰骶椎退变性疾病常用的有效治疗手段，其中骨移植替代材料是影响融合成功的关键因素之一。由胶原蛋白吸附的rhBMP-2已被FDA批准应用于腰椎前路椎体间融合，但仍存在释放时间短以及难以调控等缺点。本项目针对以上缺点，将骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的有效序列P24肽链与丝素蛋白的有效序列（GAGAGS）共价结合，获得SF/BMP-2活性肽，表征其分子量和纯度，测定体外释放曲线，探讨活性肽的生物活性，即促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力，测定异位成骨能力，并利用大鼠脊柱后外侧融合模型评估活性肽促进脊柱融合的能力。结果表明，活性肽为BMP-2有效序列（P24肽链）与丝素蛋白有效序列（GAGAGS）共价结合的产物，与理论设计的平均分子量完全一致。活性肽的释放与BMP-2趋势相似，双向缓释有利于在早期成骨获得有效的剂量，而后期缓释剂量有利于持续促进成骨。活性肽可促进骨髓间充质干细胞增殖并向成骨细胞分化，持续诱导成骨，有效促进脊柱融合。以第一或通讯作者身份发表SCI论文12篇；获得2017年国家科技进步二等奖（第二名）和江苏省科技进步三等奖（第一名）；获得国家专利1项；培养全日制毕业博士生1名，硕士生8名。