拟南芥新微管结合蛋白PCMD调控扁平细胞形态建成的分子机理

Pavement cells are a primary cell type on the leaf epidermis. They act as a barrier to protect plants from various environmental stimulus. The development of pavement cell represents an ideal system for studying cell morphogenesis. Some progresses in the research of pavement cell development have been made, however, new regulators and mechanisms remain to be found. We have identified a mutant with long and narrow pavement cells and named it pcmd (pavement cell morphogenesis defect). PCMD encodes a protein with unknown function. The protein PCMD exhibits microtubule associated subcellular localization. Moreover, recombinant PCMD binds to and bundles microtubules in vitro. These results indicate that PCMD is a novel microtubule-associated protein. In addition, two phosphorylation sites in PCMD have been also identified by mass spectrum. In this project, we plan to carry out cDNA library screening, co-IP/MS assay and genetic analyses to identify the direct targets of PCMD in pavement cell development. Furthermore, to uncover the crucial role of PCMD in pavement cell morphogenesis, we will perform an in-depth research on how microtubule stability and dynamics are regulated by PCMD together with its interacting proteins. This project will be critical for revealing the biological function of the novel gene PCMD and expanding the molecular mechanisms of pavement cell development. Moreover, it will be potentially used for improving crop stress resistance.

扁平细胞是构成叶片表皮的主要细胞，是植物应对环境刺激的最主要外部屏障，其发育是研究细胞形态建成的理想模型。扁平细胞发育的研究已经取得了一些进展，但新的调控因子和机制亟待发现。本项目前期工作鉴定到一个拟南芥扁平细胞形态建成缺陷突变体pcmd。PCMD基因编码一个功能未知蛋白，其具有微管相关的亚细胞定位，体外能够结合微管并参与微管成束，表明PCMD是一个新的微管结合蛋白。此外，质谱分析还发现了PCMD的2个磷酸化修饰位点。本项目在此工作基础上利用文库筛选、质谱分析、遗传分析等方法寻找与PCMD互作的参与扁平细胞发育的靶蛋白。通过深入研究PCMD与其互作蛋白如何共同调控微管稳定性和动态变化，阐明PCMD在扁平细胞形态建成中的作用。本研究对揭示新基因PCMD的生物学功能，丰富和拓展扁平细胞发育调控机制具有重要理论意义，同时也将在提高农作物抗逆性等方面具有重要的应用价值。

扁平细胞是构成叶片表皮的主要细胞，是植物应对环境刺激的最主要外部屏障。同时，扁平细胞发育成为研究细胞形态建成的理想模型。虽然扁平细胞发育的研究已经取得了一些进展，但新的调控因子和机制亟待发现。本项目前期工作鉴定到一个拟南芥扁平细胞形态建成缺陷突变体pcmd。PCMD基因编码一个功能未知蛋白，与微管共定位，体外能够结合微管并参与微管成束。结构域功能分析发现，PCMD包含一个未知的微管结合结构域。这些实验结果表明PCMD是一个新的微管结合蛋白。此外，我们发现了PCMD的4个磷酸化修饰位点（145，155，167和169位的丝氨酸残基）。这4个磷酸化位点的模拟磷酸化突变PCMD S145D S155D S167D S169D和模拟去磷酸化突变PCMD S145A S155A S167A S169A均能够改变PCMD的亚细胞定位，使其在细胞核中积累。同时，在野生型中分别超表达PCMD S145D S155D S167D S169D和PCMD S145A S155A S167A S169A均表现出显性负效应，产生类似pcmd突变体的扁平细胞发育缺陷表型，表明磷酸化修饰对PCMD基因亚细胞定位及其在调控扁平细胞形态建成中的功能至关重要。通过质谱分析，我们还鉴定到PCMD的互作蛋白——磷酸酶PP2A的调节亚基TON2。PCMD通过与TON2互作能够招募PP2A到微管。在ton2突变体中，PCMD的蛋白表达量显著下调。遗传分析发现，TON2和PCMD协同调控扁平细胞形态建成。这些实验结果表明PCMD是PP2A新的底物，PP2A很可能通过对PCMD去磷酸化修饰调控扁平细胞发育。通过功能分析包含PCMD微管结合结构域的同源基因，我们发现PCMDL1/2/3都具有微管相关的亚细胞定位，是3个新的微管结合蛋白。其中，PCMDL2能够与TON2和激酶PID互作，很可能受到PID和PP2A介导的磷酸化和去磷酸化调控。总之，本研究揭示了新基因PCMD的生物学功能，丰富和拓展了扁平细胞发育调控机制，同时发现了新的微管结合蛋白PCMDL1/2/3，本研究将在提高农作物抗逆性等方面具有重要的应用价值。