代谢工程改造大肠杆菌积累莽草酸的关键问题研究

莽草酸及其代谢产物多具有手性结构，在化学合成和生物制药等领域占有十分重要的地位。本课题运用易错PCR、DNA 改组和多位点突变相结合的技术，对莽草酸代谢途径的限速酶（aroB）进行定向进化，筛选酶活性显著提高的突变体。在此基础上，选择莽草酸代谢途径的关键酶, 利用多基因-启动子改组技术构建表达载体，转化aroK和aroL基因缺失型大肠杆菌，筛选性状明显改善的转化子。通过代谢产物分析确定最优的基因-启动子组合，进而探讨莽草酸代谢途径的调控机制，为利用大肠杆菌生物合成莽草酸及其代谢产物打下坚实的基础。本研究中采用的策略和阐明的相关机制，将为代谢工程改造大肠杆菌生产莽草酸及其它天然产物提供具有普遍意义的理论参考。

莽草酸及其代谢产物多具有手性结构，在化学合成和生物制药等领域占有十分重要的地位。本课题（研究期限一年）对莽草酸代谢途径的限速酶（aroB）进行定向进化，利用易错PCR技术构建了aroB基因突变体文库，并以aroB基因缺失产生的营养缺陷型菌株为宿主，通过基因功能回补实验对突变体文库进行筛选，进而考察生长良好的突变体的蛋白表达量和酶活性，最终获得一株酶活性显著提高的突变体。本课题构建了双基因缺失菌株E. coli ΔaroL/aroK，研究表明aroL和aroK基因的缺失对菌体的生长代谢影响甚微，可以显著提高大肠杆菌合成莽草酸的能力。最后，选取莽草酸代谢途径的四个关键酶基因（aroG，aroB，tktA和aroE），依次将四个基因连接进载体pETDuet-1（含T7启动子）中，成功构建重组质粒pETDuet-GBAE，为进一步研究莽草酸代谢途径的调控机制打下了坚实的基础。