基于FRET技术血清RNase A的检测及其在肿瘤诊断应用中的研究

RNase A has been characterized for a long time, but methods have not been extensively explored to measure its activity accurately and robustly. In our preliminary study, we comprehensively studied the properties of double-stranded RNA as a new type of RNase A substrate, and revealed that serum RNase A predominantly cleave double-stranded RNA site-specifically at two dinucleotide sites(CA/UG and UA/UA). Using this as a guideline, we designed and characterized a FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer ）method to measure the site-specific activity of human serum RNase A. The dynamic range of the RNase A assay was from 10-8 to 0.1 mg/ml. Assessment of site-specific RNase A activity was carried out on the serum from 11 different type of cancers including 303 patients and 128 healthy controls using the new method. RNase A activity was found to be markedly reduced in patients with gastric cancer,colon cancer and lung cancer. In this study , we will further optimize this method to provide a comprehensive guideline for quantification of RNase A activity in human cancers and elucidate the relationship between RNase A and specific cancer types, thus demonstrate site-specific serum RNase A activity might serve as a novel biomarker to facilitate tumor diagnosis.

核糖核酸酶A（RNase A）是血清中一个重要组分，但目前仍没有一种可以灵敏定量检测血清中RNase A的方法。根据申请人所在实验室在小核酸降解方向研究中所揭示的RNase A对双链RNA降解的位点特异性，我们选取了具有血清特异性切割位点（CA/UG和UA/UA）的siRNA作为检测RNase A活性的特异性底物，设计了基于荧光共振能量转移（FRET）原理的RNase A活性检测方法。通过此方法检测小RNA分子是否被RNase A降解的状态，进一步可以检测RNase A活性，检测灵敏度可达10-8mg/ml。在对11种肿瘤303例病人血清以及128例健康人对照的初步研究中发现胃癌、结肠癌和肺癌中RNase A活性显著下降。本申请项目拟优化FRET方法，扩大样本量，进一步探讨血清中RNase A与肿瘤发生发展、分类和预后之间的关系，这将对RNase A作为一项肿瘤诊断标记物具有重要指导意义。

核糖核酸酶A(RNase A)被证明与癌症发生发展相关，而囿于灵敏特异的RNase A检测方法，RNase A在肿瘤患者血清中的变化水平在文献报道中差异较大。基于申请人所在实验室在小核酸降解方向所揭示的RNase A对双链RNA降解的位点特异性，选取了具有血清特异性切割位点（CA/UG和UA/UA）的siRNA作为检测RNase A活性的特异性底物，设计了基于荧光共振能量转移（FRET）原理的RNase A活性检测方法。通过检测小RNA分子是否被RNase A降解的状态，可以检测RNaseA活性和含量。本项目对RNase A检测方法进行了深入优化，同时建立了ELISA法和Biotin标记法作为比较，研究表明FRET方法具有更好的灵敏性和特异性。在对11种肿瘤303例病人血清以及128例健康人对照的初步研究中发现胃癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和肺癌中RNase A活性显著下降，而在乳腺癌和结肠癌中RNase A变化不大。我们进一步扩大样本量，获得包括胃癌、结肠癌和肺癌的样本743例，为探讨血清中RNaseA与肿瘤发生发展的关系奠定了基础。在对75例具有完善病理资料样本分析中，胃癌、结肠癌和肺癌中RNase A活性显著下降，乳腺癌中RNase A变化不大。血清中RNase A与肿瘤类型、预后之间的关系有待大样本验证和随访资料完整后进行后续研究。同时，我们对切割位点化学修饰对siRNA两条链的活性影响进行了系统的研究。结果发现，siRNA一条链上第9、10位的甲氧乙基（2’-O-MOE）修饰可以通过影响siRNA两条链在RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的装载量，提高siRNA修饰链的活性，降低未修饰链引起的脱靶效应。siRNA一条链第9、10位的2’-O-MOE修饰与另一条链第14位的甲基（2’-O-Me）修饰联合，可以发挥协同作用，更好的提高siRNA的特异性。该研究为设计RNase A 的降解底物做了有益理论补充和指导原则。在项目执行过程中，相关研究凝集为7篇研究论文，申请人参与编写专著2部，作为成员获得北京市科学技术奖三等奖1项。