APOBEC3对潜伏HIV-1的激活作用及其与DNA甲基化修饰的关系

HIV latent reservoir is the major barrier to the eradication of HIV-1 infection. Methylation of HIV-1 5' LTR CpG contributes to the maintenance of HIV-1 latency. Currently, the key of reservoir elimination and HIV eradication is how to efficiently reactivate latent virus. Our primary data indicated that A3A from APOBEC3(A3) family was able to reactive the latent HIV-1. And the data also suggests that A3A induced viral reactivation was associated with its 5-methyl cytosine (5mC) deaminase activity via promoting 5' LTR 5mCpG demethylation. Therefore, in this study, the A3 family proteins will be screened to identify the ones with 5-methyl cytosine deaminase activity. Then their functions in promoting 5' LTR CpG demethylation and latency reactivation will be evaluated in highly methylated J-Lat cells, by bisulfite sequencing and qRT-PCR. The mechanisms of promoting 5' LTR demethylation will be studied by RNA interference, Co-IP and ChIP. Overall, our finding will uncover the action of A3 in reactivation of HIV latency and in epigenetic modification; it will also provide valuable information in designing novel latency-reversing agents.

病毒潜伏库的存在是全面清除HIV-1感染的主要障碍，而HIV-1 5' LTR的CpG甲基化是病毒潜伏库维持的重要因素。如何有效的激活潜伏病毒，已成为目前清除潜伏库、治愈艾滋病的关键。我们前期研究发现：APOBEC3(A3)家族成员A3A可激活潜伏病毒，并推测这与A3A利用其甲基化胞嘧啶脱氨酶活性，催化5' LTR甲基化CpG去甲基化有关。本项目在此基础上，首先利用体外实验，筛选出A3家族中具有甲基化胞嘧啶脱氨酶活性的分子；然后在5'LTR高度甲基化的J-Lat潜伏细胞中，利用重亚硫酸盐测序、qRT-PCR，探讨这些分子对5' LTR CpG甲基化程度、病毒活化的调节作用；并通过RNA干扰、Co-IP和ChIP，对其催化5' LTR DNA去甲基化的分子机制进行研究。以期揭示A3在激活HIV-1中的作用及其表观遗传学机制，为新型病毒激活剂的研发奠定基础。

HIV-1 5'LTR作为病毒转录的唯一起点，该区域内胞嘧啶的甲基化修饰（5mC）与病毒潜伏感染的维持密切相关。APOBEC3（A3）是一类具有DNA编辑功能的胞嘧啶脱氨酶，为明确A3家族分子对HIV-1 5'LTR中5mC的识别及甲基化程度的调节作用，本项目首先建立了以HIV-1 5'LTR为启动子的DNA甲基化/去甲基化报告系统pLTR-Luc2P-EGFP，通过检测代表下游基因表达水平的荧光素酶活性，即可真实、有效地反映出被转染细胞内5'LTR中5mC的甲基化程度。随后，利用该系统对A3分子5mC去甲基化能力进行评价。结果显示A3A去甲基化能力最强，A3B和A3C次之，A3G和A3F不具有该功能。通过与不具酶活性的A3A-E72A比较证实，胞嘧啶脱氨酶活性是其发挥去甲基化功能所必须的。最后，为探讨A3催化DNA去甲基化的分子机制，以催化能力最强的A3A为研究对象，通过加入抑制剂、干扰RNA等方式对碱基切除修复（BER）途径中多个环节进行阻断，证实A3A是通过胞嘧啶脱氨基-BER途径催化5mC去甲基化的。同时，Co-IP研究发现A3A可与该通路中下游元件TDG、MBD4相互作用。至此，本项目证实了在A3家族中，部分A3分子可识别HIV-1启动子5'LTR中5mC，并诱导其主动去甲基化，激活下游基因的表达。同时阐明了其诱导5mC去甲基化的分子机制，即A3分子通过催化5mC脱氨基，形成胸腺嘧啶，通过胞嘧啶脱氨基-BER途径，完成DNA主动去甲基化。本项目从分子水平上对细胞内HIV-1启动子5'LTR中5mC主动去甲基化过程进行了解读，阐明了胞嘧啶脱氨酶A3在5mC去甲基化中的作用，极大地推动了对DNA主动去甲基化机制的认识。同时为潜伏感染细胞内，HIV-1的活化提供新的思路，为研发高效、安全、可行性高的潜伏感染激活剂，清除潜伏库提供了新的靶点。