活细胞FRET双杂交检测技术及其应用研究

Non-destructive measurements on the formation and disassociation of biomacromolecule complexes and their stoichiometries in live cells becomes an imperative requirement for life science research, and fluorescence resonance energy transfer (FRET) two-hybrid assay is a valuable method in which a single cell is considered to be a biological cuvette for detecting and quantifying binding interactions between biological macromolecules in living cells. Based on our previous studies on the quantitative measurement methods, this project plan to develop novel live-cell FRET two-hybrid assay methods by simultaneous spectral unmixing of both excitation and emission spectra (ExEm-FRET) for high-efficient live-cell FRET measurements by bypassing the rigorous restriction of keeping the constant instrument parameter settings in all quantitative FRET measurements; This project also develop novel ExEm-FRET two-hybrid assay instrument and data analysis approach . Meanwhile, this project is going to use the FRET two-hybrid assay methods to study the binding affinity between Bcl-2 family proteins and the stoichiometries of the Bcl-2 family protein complexes in living cells for exploring their molecular regulation mechanism for cell proliferation and cell death. This project not only develops and drives the application of the FRET-two-hybrid assay but also provides a powerful tool for life science research.

在活细胞中无损检测生物大分子复合体的形成、分离及其结构组份计量比是生命科学研究的迫切需求。荧光共振能量转移(FRET)双杂交检验是进行活细胞滴定实验研究必不可少的研究技术。在前期研发的多种活细胞定量FRET检测技术和显微定量FRET检测仪的基础上，本项目拟重点发展基于激发发射光谱分离的活细胞FRET双杂交检验新技术，克服整个定量FRET检测过程系统参数恒定的苛刻限制条件，提高活细胞FRET双杂交检验的成功率；同时研发基于该技术的活细胞FRET双杂交检验系统和数据分析方法。在此基础上，利用活细胞FRET双杂交检测技术在活细胞中研究Bcl-2家族蛋白分子间的亲和力及其复合体的组份结构计量比与功能，揭示Bcl-2家族蛋白调控细胞生长和凋亡的精确调控机制。本项目不仅将发展和推广活细胞FRET双杂交检验技术及其应用的研究，填补国内研究空白，而且将为生命科学研究提供强有力的技术手段。

FRET双杂交检验技术是目前唯一可以实现活细胞中生物大分子“滴定”检测的技术，用于解析活细胞中复合生物大分子结构计量信息和分子间相对亲和力大小，是在活细胞中研究生物大分子结构信息和功能信息不可或缺的技术手段。本项目的主要研究内容包括发展新型的活细胞FRET双杂交检验技术和数据分析方法及其在活细胞中细胞凋亡Bcl-2家族蛋白分子的结构与功能。本项目取得如下重要成果：（1）发展了基于全光谱分离的定量FRET双杂交检验技术，研究成果2019年发表于Optics Express；（2）发展了用于活细胞内多种不同结构复合生物大分子分析的高斯型FRET双杂交技术，并实现了活细胞内两种不同结构分子的结构信息解析，研究结果2019年发表于Biochemical and Biophysical Research Communications；（3）发展了多种定量FRET成像系统的校正方法，为研发智能型定量FRET 成像分析系统奠定了技术基础，研究成果获得2项国家发明专利，并发表在Optics Express（2022）和Microscopy and Microanalysis（2021）；（4）研发了自动 ExEm-spFRET 显微镜，研究成果发表于 Microscopy and Microanalysis（2022）；（5）利用FRET双杂交检验技术在活细胞中研究Bcl-2家族蛋白调控细胞凋亡的分子调控机制，揭示了系列新机制，发表系列学术论文，包括Free Radical Biology and Medicine（2022）、Cell Death Discovery（2021）、Cellular and Molecular Life Sciences（2020）、Journal of Cell Science（2020）、Apoptosis（2019）和Journal of Biochemistry and Cell Biology（2020）等。.按照项目研究计划开展了研究，完成了项目的各项研究内容，并超额完成了各项指标要求。本项目资助的研究成果包括发表学术论文43篇（原计划6 篇以上），其中第一资助论文23篇，第二资助论文17篇，第三资助论文3篇；获得国家授权发明专利6项（原计划1-2项）；获得软著2项；培养博士生5人（原计划3-4人），培养硕士研究生12人（原计划6人）。