人源非编码小RNA膜蛋白转运复合体冷冻电镜研究

The non-coding small RNAs possess important biological functions, but it still remains elusive that how the heterologous small RNAs could be transported across the membrane and enter the cell. Functional studies found that the existence of membrane protein small RNA transporters play key roles in the process of heterologous non-coding small RNA transportation. . Human small RNA transportosome 1 (hRT-1) is encoded as a membrane protein with a molecular weight of nearly 100,000 Dalton. hRT-1 contains 11 transmembrane helices, could form biological multimers and functional ternary complex by organizing its own and other macromolecules. Meanwhile, hRT-1 contains complicated protein post-translational modifications like glycosylation etc, thus it is very difficult to conduct the structural studies by X-ray crystallography.. In this project, we will carry out structural analysis for human hRT-1 with the help of powerful Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM), using single particle 3D reconstruction technology, and combine with X-ray crystallography, to determine the ternary complex of human hRT-1 transporter, and reveal the mechanism of non-coding small RNA transmembrane transportation. The elucidation of this mechanism will play a great role in the promotion of development of non-coding small RNA based drugs and related biotechnology.

非编码小RNA有着重要的生物学功能，但是目前对于异源小RNA如何进入细胞的过程尚不清楚。功能研究结果发现人类消化道细胞膜上存在非编码小RNA膜蛋白转运体hRT-1（human small RNA transportosome 1），它在异源非编码小RNA进入细胞的过程中起着关键作用。.人源hRT-1是单体分子量近10万的膜蛋白，包含11次跨膜螺旋，自身与其他大分子能够形成多聚化的活性状态，同时它含有复杂的糖基化等蛋白翻译后修饰，利用X射线晶体学研究其结构与功能存在很大的难度。.本项目中我们针对人类hRT-1开展冷冻电镜结构研究，利用单颗粒重构技术研究其三维结构，结合X射线晶体学，阐释其跨膜转运非编码小RNA的作用机制，这个机制的阐明对于基于非编码小RNA的药物研发与相关生物技术将有着巨大促进作用。

非编码小RNA有着重要的生物学功能，但是目前对于异源小RNA如何进入细胞的过程尚不清楚。对于小RNA的功能性研究结果发现人类消化道细胞膜上存在非编码小RNA膜蛋白转运体，它在异源非编码小RNA进入细胞的过程中起着关键作用。如果能够深入了解食源性小RNA进入人体的分子机制与原理，不仅能够极大的拓展人类关于非编码小RNA跨膜转运与调控人体机能的认识，也能够为人类开发利用非编码小RNA药物奠定相关基础。.本项目中我们尝试利用单颗粒重构技术研究其三维结构并阐释其跨膜转运非编码小RNA的作用机制。.在项目的4年执行期内，我们针对人类RNA膜蛋白转运体开展了冷冻电镜结构研究，完成了人源RNA膜蛋白转运体胞外水溶区与全长膜蛋白的蛋白质基因工程表达与纯化，尝试了多种方法制备并稳定人源RNA膜蛋白转运体，同时开展了冷冻电镜样品制备与数据收集，取得了一系列的结果，但由于样品在冷冻电镜载网上存在严重的各向异性，通过多种方法也未能获得积极改善，目前只获得了6.5埃低分辨率的人源RNA膜蛋白转运体胞外区冷冻电镜初步结构及14埃左右的全长蛋白初步轮廓，尚未能解析高分辨率结构。在项目执行期内，我们解析了重要生物功能复合体signalosome中CSN2亚单位的晶体学结构，论文发表在2020年PNAS上。我们解析了人IGF1R受体冷冻电镜结构，论文发表在2020年structure上。