新型（类）自身免疫肝炎小鼠模型建立和机理研究

AIH (Autoimmune hepatitis) is a serious disease with high mortality and complex pathological mechanism. Animal model is essential for the mechanism research and drug screening of AIH. There are three types of AIH animal model, such as liver homogenate induced model, genetic engineering mice and lectin/LPS induced hepatitis models. Immune tolerance broken and activation of T cells, NK cells, NKT cells or macrophages were the pathological mechanism of these models. We reported a galectin AAL, which could induce liver injury (Toxicon, 2014). The pretreatment of anti-CD4, anti-CD8 and immunosuppressant CsA resulted in more severe symptom on mice. The similar result was obtained in AAL treated CD8-/- mice. All the preliminary data suggested that pathological mechanisms of AAL model was totally different from other animal models, which was closely related to the immunosuppression. The aim of this project is to develop a new AIH-like animal model and investigate the pathological mechanism. These experiments should be performed in this project: 1) The mice will be treated with different concentrations of AAL, and the blood index, tissues (liver, spleen) sections, cytokines in blood and tissues will be tested at different time points; 2) The main functional subgroup immune cells in hepatitis will be identified by blocking immune cells using various antibodies and gene knock-out mice; 3)The active signal pathway will be identified by IP, MS and Western Blot; 4) The key functional sites of AAL will be screened by testing the hepatitis induced activity of AAL-mutants; 5) At last, the clinical significance of AAL model will be evaluated by clinical samples.

自身免疫性肝炎的病因复杂，死亡率高，建立动物模型对病理研究和药物筛选至关重要。目前主要有肝脏匀浆模型、遗传工程模型、凝集素和内毒素等诱导模型，都是以激活免疫细胞、打破自身免疫耐受而诱导的肝炎模型。本研究小组鉴定的新凝集素AAL可以诱导小鼠肝炎（Toxicon，2014），然而，用免疫抑制剂CsA、antiCD4、antiCD8预处理小鼠，使肝炎症状加重。这些研究结果说明AAL诱导肝炎的机理与现有动物模型机理完全不同，有可能与免疫抑制密切相关。本研究计划建立新的肝炎模型并初步阐明其机理：1）用不同浓度AAL处理小鼠，在不同时间检测各种肝炎相关指标（血液指标，细胞因子等）；2）用多种抗体、试剂处理小鼠，鉴定该模型的主要诱导细胞亚群；3）用IP-质谱、Western等方法研究主要激活信号通路；4）AAL及其突变体处理小鼠，鉴定AAL的关键作用位点；5）检测临床样本，评价AAL模型的临床意义。

研究背景及重要研究内容：自身免疫性肝炎（AIH)是一种严重的高死亡率疾病，目前的治疗手段有限，研究该疾病的病因仍然是非常紧迫的。该疾病病因复杂，已建立的几种动物模型不能完全满足该疾病的研究需要。由于病因的多样性，该领域还需要更多的动物模型。我们成功建立了一种新的真菌凝集素AAGL (Agrocybe aegerita galectin)诱导的小鼠AIH急性肝损伤模型。该AAGL-诱导模型是一个全新的模型，与广泛应用的ConA（刀豆蛋白A）模型相比，AAGL模型表现出完全不同的免疫机制。ConA诱导的肝损伤可以被predisonone，环孢菌素等免疫抑制剂抑制，而AAGL诱导的急性肝损伤不能被predisonone，环孢菌素等免疫抑制剂缓解，反而造成更严重的肝损伤。.重要结果及科学意义：1）AAGL模型可以作为临床上对免疫抑制剂治疗不敏感的急性肝损伤模型，有重要临床意义。2）IL-10和IL-1β在AAGL有可能作为临床免疫抑制剂治疗耐受型AIH急性肝损伤的生化指标。静脉注射AAGL可诱导T、NKT、NK细胞活化并向肝细胞浸润。肝组织的转录组分析表明，趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症反应在AAGL和Con A模型中存在显著差异差异。其中，IL-10和IL-1β是AAGL诱导类-AIH急性肝损伤模型中的最重要细胞因子，IL-10和IL-1β在AAGL处理小鼠中显著升高表达，有可能可以作为临床免疫抑制剂治疗不敏感类型的急性肝损伤的生化指标。3）IL-1β抗体可能作为免疫抑制剂耐受AIH的候选药物。我们发现IL-1b通过招募T细胞进入肝脏在AAGL模型的发病机制中发挥关键作用，抗IL-1β抗体可通过抑制NF-kB和p38信号通路改善AAGL诱导的肝损伤，肝脏中负责T细胞浸润的CXCL9的表达也受到抑制。 4）GA（格拉替雷）可以作为免疫抑制剂耐受AIH的候选药物。GA是治疗多发性硬化症的一线药物，我们的研究表明GA可以有效缓解AAGL引起的肝损伤，但是不能缓解ConA引起的肝损伤。GA有可能作为免疫抑制剂耐受型AIH的治疗药物，对临床有重要参考价值。5）AAGL能有效活化巨噬细胞，我们对AAGL在淋巴细胞上的受体进行了鉴定。6)O-GlcNAc修饰在肝炎和肝癌发生过程中都有重要作用。我们在小鼠肝脏中鉴定了54个O-GlcNAc修饰蛋白。