弓形虫TgMIC16在入侵中的生物学特性及与宿主细胞（HFF）蛋白互作的研究

Toxoplasma gondii microneme protein 16 (TgMIC16) is a new thrombospondin related anonymous protein (TRAP) protein which characterized by TRAP and located in microneme. The TRAP protein is an important protein associated with the invasion and plays the role of transmembrance link during sporozoite invasion. What are the invasion biological characteristics of TgMIC16? And, what is the interaction between the TgMIC16 and host cell? In the proposed project, immunofluorescence technique is adopted to identify the extracellular and intracellular localization of TgMIC16 and elucidate it distribution among the different time points of tachyzoite invasion. We analyze the function of TgMIC16 in adhesion and invasion of host cell by Calcium-dependent secretion of TgMIC16, in vitro invasion and inhibition of adhesion assay, and host cell (HFF) binding assays. And then, we employ yeast surface display and Co-Immunoprecipitation methods, systematically screening and identification TgMIC16 interacted host cells (HFF) proteins. The elucidation of the biological characteristics of the TgMIC16 and interaction between it and host cell protein would pay way for study the invasion mechanism and multiplication within host cells in T. gondii.

弓形虫新发现的TRAP蛋白—微线蛋白-16（TgMIC16）具有典型的TRAP蛋白结构且满足TRAP蛋白定位于微线体的定位特征。TRAP蛋白在弓形虫粘附和入侵宿主细胞时形成跨膜链接，是一类与入侵相关的重要蛋白，那么，TgMIC16蛋白是否具有与入侵相关的生物学特性？TgMIC16蛋白与宿主细胞蛋白发挥怎样的相互作用？本项目首先对TgMIC16蛋白胞外和胞内定位，阐明其在虫体入侵中的时空动态表达；通过TgMIC16蛋白分泌特性的鉴定、体外入侵与粘附抑制试验、TgMIC16与宿主细胞（HFF）的粘附，分析该蛋白在弓形虫速殖子粘附、入侵宿主细胞中可能存在的作用；同时结合酵母表面展示和Co-IP免疫共沉淀技术，筛选鉴定与TgMIC16蛋白相互作用的宿主细胞（HFF）蛋白。系统阐明TgMIC16在入侵中的生物学特性及与宿主细胞相互作用蛋白的功能，为探究弓形虫入侵机制及胞内繁殖调控机制奠定基础。

弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii, T. gondii）引起的呈世界性分布的人兽共患传染病。但目前为止，尚未有安全、有效的疫苗用来预防人类弓形虫病。TgMIC16是新发现的一类TRAP蛋白， TRAP 蛋白在虫体入侵中发挥重要作用。. 本项目的主要研究内容，首先明确了TgMIC16在弓形虫速殖子阶段的亚细胞定位，然后分析了该蛋白与入侵相关的蛋白特性，最后，筛选鉴定TgMIC16与宿主细胞（HFF）的互作蛋白。. 本研究以弓形虫TRAP蛋白TgMIC2为对照，以TgMIC16为研究对象，首先完成了TgMIC2和TgMIC16重组蛋白的表达、纯化，然后分别免疫小鼠和新西兰大白兔制备了多抗，利用IFA对TgMIC16进行了亚细胞定位，结果表明，该蛋白定位于弓形虫微线体。对TgMIC16的蛋白特性进行了检测分析，包括TgMIC16分泌特性的鉴定、与宿主细胞（HFF）的结合试验与抗体阻抑入侵，结果显示，在弓形虫分泌抗原中未检测到TgMIC16，抗体阻抑入侵率为12%。同时，利用生物信息学分析TgMIC16的B/T细胞抗原表位，并基于酵母表面展示系统（pCTCON2/EBY100）对该抗原表位区（TgMIC16T）和全长TgMIC16进行优化表达，结果表明，TgMIC16T表达成功，而全长TgMIC16的表面展示效率过低，而无法完成后续互作蛋白的筛选。因此，我们改用酵母双杂交的方法，制备了HFF细胞的均一化、三框表达酵母双杂交cDNA文库，该文库在库容量、插入片段长度和重组率等方面均符合cDNA文库构建要求；构建TgMIC16诱饵质粒，在确认了该蛋白没有自激活和毒性的前提下，与HFF细胞cDNA文库进行融合实验，筛选到3个互作蛋白（FLNB、DENND5A 和CALM1），经共转染验证，3个蛋白均存在自激活，均为假阳性。虽然本项目未能筛选到与TgMIC16互作的宿主蛋白，但是，本项目为TgMIC16功能研究奠定基础，构建的HFF细胞酵母双杂交cDNA文库为后续研究提供素材，可供高通量筛选互作蛋白50余次。