猴头菇阿魏酸酯酶高活性分子机制研究

Ferulic acid esterases (FAEs) play an important role in effectively biodegradation of lignocellulose. But the activity of the reported FAEs is generally lower and the activity regulative mechanism is unknown, which restrict the development of the enzyme with high catalytic activity. In this study, we use the high activity Hericium erinaceus FAE that has been purified to electrophoretic purity as experimental material, analysis its peptide sequence and N-terminal amino acid sequence to obtain its full-length sequence, and express it in Pichia pastoris; then construct the mutant library by random mutagenesis and obtain the mutants which activity are markedly changed by high throughput screening method; finally, identify the activity-related key amino acids by sequence analysis combined with site-directed mutagenesis and forecast the effect and mechanism of the amino acids on FAE activity by bioinformatic and homology modeling methods. This study will provide theoretical evidence for elucidating the molecular mechanism of high active H. erinaceus FAE, and also will provide theoretical guidance for further improving and modification the enzyme.

阿魏酸酯酶在木质纤维素高效降解中发挥重要作用，但目前已报道的阿魏酸酯酶普遍活性较低，且有关其活性机制的研究未见报道，一定程度上限制了高活性阿魏酸酯酶的研发。本研究拟以前期分离纯化的高活性猴头菇阿魏酸酯酶为对象，对电泳纯的阿魏酸酯酶进行N端测序和质谱测定，并通过逆转录PCR（RT-PCR）及cDNA末端快速克隆技术（RACE）克隆该酶基因并进行毕氏酵母表达分析；之后利用易错PCR技术对阿魏酸酯酶基因进行随机突变并构建突变体库，通过高通量筛选获得活性显著改变的突变株；最后对野生型及突变型阿魏酸酯酶基因进行序列比对分析及定点突变验证，并结合生物信息学与同源建模方法分析关键氨基酸位点与酶活性关系及影响机制。预期探明调控猴头菇阿魏酸酯酶活性的关键氨基酸位点及作用机制，为阐明猴头菇阿魏酸酯酶高活性的分子机制奠定基础，并为后续开展猴头菇阿魏酸酯酶活性改造研究提供理论依据。

阿魏酸酯酶是一种羧酸酯水解酶，它可以水解植物细胞壁中半纤维素与木质素之间或者半纤维素之间通过阿魏酸相连形成的酯键，降解植物细胞壁的同时，将阿魏酸游离出来，因此在食品、化妆品、医药、饲料、造纸工业以及生产生物乙醇领域有广泛的应用前景。本项目以筛选获得的一株高产阿魏酸酯酶的猴头菇菌株为材料，首先优化其诱导产阿魏酸酯酶条件，并综合利用离子交换层析、凝胶过滤层析和SDS-PAGE等方法对该酶进行了分离纯化，获得了电泳纯的阿魏酸酯酶，分子量约为60 kDa，通过质谱鉴定，获得的四个肽段序列LESYIK，GIAPETIR，ISNGQHTWPRR和LTGPGSELR，与已知阿魏酸酯酶有较高的相似性；该酶最适反应温度为50 ℃，且在20~60 ℃具有较高的稳定性；最适反应pH为5.0，为偏酸性阿魏酸酯酶；Hg2+，Cd2+，Cu2+和Al3+等金属离子对该酶的抑制作用较强，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等金属离子对该酶具有一定的促进作用。通过酶的协同作用得出木聚糖酶、纤维素酶和阿魏酸酯酶在麦麸高效降解中起到显著的协同作用，可以从去淀粉麦麸中释放出68.1%的还原糖，81.9%的阿魏酸：还原糖释放率比单独添加同等浓度的纤维素酶提高29.1%，比单独添加同等浓度的木聚糖酶提高36.2%；阿魏酸释放率比单独添加同等浓度的阿魏酸酯酶时提高52.6%。本项目结合实验结果，初步揭示了猴头菇阿魏酸酯酶在麦麸素高效降解中的作用机制。