食品防腐环境下食源细菌应激进入活的非可培养态的机制研究

食品防腐剂能够诱导部分食源致病细菌进入活的非可培养态(VBNC)。该状态细菌虽失去平板生长繁殖能力但仍具产毒特性，且在适当条件下能复苏，很快达到致病剂量，这一现象对食品防腐保藏安全带来严峻威胁。因此，亟需深入开展对VBNC的产生机理及快速检测研究。本课题拟利用双向电泳、质谱技术结合生物信息学方法对VBNC状态转变前后的食源细菌进行差异蛋白比较分析，筛选调控VBNC状态产生的功能蛋白分子标志物，并进一步利用cDNA-AFLP方法构建mRNA指纹图谱，结合RT-PCR鉴定差异表达基因，通过分子信息学手段对差异基因进行结构分析和功能预测，阐明防腐剂诱导VBNC态产生的机理。同时，研建针对食品基质中多种VBNC细菌共存现象进行同步快速检测技术体系。该研究将有助于深入了解VBNC食源细菌在防腐剂胁迫下产生抗性的机理，并为控制其在食品中的隐性残留奠定理论基础和可行性方法。

食源性致病菌活的非可培养状态（VBNC状态）的研究在食品安全、食品卫生检验、食品储藏等许多方面具有重要意义。本研究利用食品防腐剂山梨酸钾和低温等条件诱导食源细菌进入VBNC状态，对VBNC菌体的复苏以及VBNC状态的金黄色葡萄球菌生物学特性和复苏后菌株的应激特性进行了研究，并建立了快速高效的检测VBNC状态食源细菌的分子方法。.研究结果发现：1）0.5 mmol/L山梨酸钾、寡营养状态、-20 ℃条件可以诱导食源细菌进入活的非可培养状态，可培养细菌数为零；2）以显微镜、扫描电镜对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌的VBNC状态进行观察，发现进入VBNC状态的菌体形态上发生了变化，金葡菌菌体分散，细胞体积缩小，而副溶血弧菌由正常的杆状、短杆状或弧状变为球状，细胞体积明显缩小；3）通过透射电镜发现，VBNC状态食源细菌细胞质密度明显降低，细胞壁变厚，细胞壁抗性明显增强，细胞壁中肽聚糖交联度明显增加；4）利用API- 20E试剂盒发现，复苏后的副溶血弧菌增加了利用尿素的能力外。利用API-STAPH 生化鉴定试剂盒对复苏的金黄色葡萄球菌进行生化鉴定，显示除了脲酶呈阴性外，其他生理生化代谢基本恢复。正常状态的金黄色葡萄球菌菌落呈黄色、有溶血圈，而复苏后的菌落呈乳白色且没有溶血圈。应激实验证明复苏后的金黄色葡萄球菌对不良环境抵抗能力比正常状态的金黄色葡萄球菌弱，推测是复苏后的金黄色葡萄球菌不产类胡萝卜素的原因；5）利用全菌蛋白SDS非连续变性电泳分析食源细菌，显示诱导30 d的副溶血弧菌蛋白条带明显比正常状态的少，但是诱导60 d即已经进入VBNC状态的副溶血弧菌的蛋白条带比诱导30 d的蛋白条带多，而比正常状态的蛋白条带少。经过SDS-PAGE分析不同状态金黄色葡萄球菌蛋白质表达的差异，发现VBNC状态的全菌蛋白明显比正常状态菌体的蛋白减少，但31 kD的蛋白量明显增加，说明进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌仍有代谢活动，合成部分蛋白。6）使用EMA与LAMP方法相结合，建立了快速检测VBNC状态食源细菌的EMA-LAMP方法以及原位LAMP方法。确定了EMA的最佳工作浓度为40 μg/mL，该方法的检测灵敏度为2 CFU/mL。通过对人工污染的模拟样品进行检测，发现食品基质不会影响EMA-LAMP灵敏度，为检测VBNC状态的细菌建立了一种新技术。