Y185对细菌视紫红质质子传输网络调控机制的固体核磁共振谱学研究

Bacteriorhodopsin (bR), a 26 kDa transmembrane pigment protein, acts as a light-driven proton pump in Halobacterium salinarum and converts light energy into chemical energy through a proton gradient cross the membrane. BR contains a polypeptide chain of 248 residues, folding into a seven-transmebrane helical topology similar as G protein coupled receptors. The retinal chromophore with the all-trans configuration is covalently bound to the K216 residue on the helix G through a protonated Schiff base. Absorption of a photon by bR initiates a cascade photo cycle that leads to transport of a proton out of the cell. Several intermediates in the photo cycle have been identified by spectroscopic techniques through which the exact nature of the changes in each step of the cycle, relating to the proton release and uptake mechanism can be studied in detail. However, there are a number of issues have still not been resolved at molecular level. In the present work, we intend to establish a set of new solid-state NMR experiments, with assisted by dynamical optical spectroscopy and molecular dynamics simulation, to study the mediation mechanism of Y185 on isomerization of the retinal chromophore and binding, and on proton release network through D85-D212-R82 H-bonding in native environment at atomic and molecular level. Establishment of the subject, not only can reveal the deep relationships among bR structure, the key residues proton pumping mechanism, but also can help the study of G protein-coupled receptors structure, function roles of key residues and activation mechanisms to a significant extent.

细菌视紫红质(bR)是一种分子量为26kDa的嗜盐杆菌膜蛋白，具有质子泵的功能，通过质子的跨膜传递将光能转化为化学能。bR由248个残基组成，与G蛋白耦联受体具有类似的七次跨膜螺旋拓扑结构。全反式视黄醛发色团通过质子化的希夫碱与bR螺旋G上的K216共价结合。bR光照后将激发一系列的光致异构反应，同时将一个质子由胞内传递到胞外。虽然bR的各中间态和质子泵的功能得到了广泛的研究，但质子传递过程中的若干问题仍无公认的答案。本课题拟建立固体核磁共振新方法并辅以动力学光谱实验和分子动力学计算，从原子和分子水平上深入研究Y185对bR质子传输网络的调控机制，揭示Y185对视黄醛发色团构象以及D85-D212-R82氢键网络调控的内在因素。课题的设立，不仅有助于更深层次地揭示bR结构、关键残基及质子泵功能间的关系，同时对深入研究G蛋白耦联受体的结构、关键残基作用和激活机制也具有指导意义。

细菌视紫红质(bachodopsin, bR)是微生物视紫红质七-跨膜光受体家族成员之一，其功能是在光照下将质子由胞内定向输运到胞外用于ATP的合成，完成光能向化学能的转化。酪氨酸185(Tyrosine 185, Y185)是位于bR分子第六个跨膜螺旋上的一个芳香性残基，被视为是视黄醛键合区及胞外侧质子释放网络的关键组成元素，可能参与调控视黄醛及胞外侧近似平面五边形的氢键网络的稳定性。然而，多年来有关Y185对光循环调控作用的研究存在很大争议，特别是Y185对视黄醛顺反异构平衡是否具有调控作用尚未见报道。. 为弥补这一研究上的欠缺，本项目采用原位固体核磁共振单自旋对选择性调控异核磁化矢量转移技术及二维同核相关实验，并辅以瞬态吸收光谱实验和量子化学、分子动力学计算，从原子和分子水平上深入研究了Y185对视黄醛发色团顺反异构平衡的调控作用、以及Y185对细菌视紫红质质子传输网络和质子泵功能的调控机制。研究首次确认Y185与希夫碱之间形成的氢键直接调控bR暗适应态(非活性态)下视黄醛的顺反异构平衡，且这一氢键在M态(活性态)的断裂促使蛋白由较刚性构象向较柔性构象的转变，完成质子的定向转移。通过Y185F突变实验，进一步阐明了氢键的缺失造成了视黄醛的顺反异构平衡的移动，D85-D212-R82氢键网络的重排，光循环M态生成的减弱和衰减延长，O态消失以及基态恢复时间的延长，最终导致蛋白三聚体装配松散以及ATP生成率降低。本研究揭示了Y185对细菌视紫红质质子传输网络的调控机制，提出了细菌视紫红质激活机制中芳香性残基微开关调控模型。首次将残基突变对光循环的影响与蛋白三聚体装配以及ATP生成率相关联，提出bR暗适应态视黄醛顺反异构平衡比例与ATP生成率的改变有着直接的对应关系。. 本项目研究不仅实现了对bR结构-关键残基-质子泵功能关系更深层次的认识，同时对认知其他微生物视黄醛家族蛋白结构-功能关系也具有很大的指导意义。此外，本项目所获得结果将有助于深入发掘bR在太阳能储存、人工视网膜、信息存储、神经网络、生物芯片以及生物防伪等领域的应用。