优化HCN基因提高生物起搏效率的研究

应用超极化激活环核苷酸门控（hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated，HCN）基因来重建心脏生物起搏点取得进展，其生物起搏详细机制不明朗。前期研究表明HCN通道电流快速激活可能利于形成快速生物起搏、缓慢失活利于维持起搏的稳定，本项目采用定点突变、离体细胞实验与在体动物实验相结合的方法，定点突变鼠HCN2（mHCN2）通道基因，使mHCN2突变体通道电流具有较mHCN2更快的激活动力学，保持mHCN2缓慢的失活动力学特点，在乳鼠心肌细胞表达，检测HCN突变体通道电流的电生理特点和对乳鼠心肌细胞动作电位、自发性搏动的影响等，进行狗心房或心室注射腺病毒HCN突变体形成生物起搏的研究，探讨HCN通道电流的激活/失活动力学在心脏起搏的启动和维持稳定节律的作用，阐明HCN通道电流的生物起搏机制，优化HCN基因以提高生物起搏效率。

对于缓慢性心律失常如病态窦房结综合征、房室传导阻滞等的治疗通常需植入永久电子起搏器，但电子起搏器在长期应用过程中仍存在一定缺陷，因此，研究人员试图应用基因或细胞来重建心脏的生物起搏点。窦房结细胞是心脏的起搏细胞，其舒张期自动去极化激活的主要机制是起搏电流（If）的激活。HCN基因参与编码If通道结构蛋白，利用病毒载体将野生型HCN基因导入动物心脏内可以重建心脏起搏点,目前在哺乳动物已克隆到4种异构型 （HCN1-4），在国内外的生物起搏的早期研究中,将野生型HCN1、HCN2或HCN4基因导入动物心脏均可以重建心脏起搏点，并没有研究比较哪种HCN基因在生物起搏的基因研究中更有优势。由于天然起搏通道为多种异构型组装的四聚体以及存在β亚单位等诸多调节因素，以野生型HCN为基础来构建新的HCN基因用于生物起搏研究成为当前国际上本领域的热点。研究内容包括：1.犬窦房结细胞的起搏电流的动力学特点，并与乳鼠心肌细胞表达起搏通道mHCN2比较。2．研究表明 GATA 4 增加骨髓基质干细胞 （MSCs）诱导分化为心肌表型，探讨是否 GATA 4 提高骨髓基质干细胞介导缺氧损伤后的心肌保护，提高细胞移植的成活率。研究成果：1.了解犬窦房结细胞的起搏电流的动力学特点，并与乳鼠心肌细胞表达起搏通道mHCN2比较。结果显示犬窦房结细胞的起搏电流的激活较mHCN2通道电流的激活略慢。突变型mHCN2在乳鼠心肌细胞表达，呈现不同激活动力学。在乳鼠心肌细胞表达后，对乳鼠心肌细胞的自发性搏动的产生不同的影响呈现出HCN2及突变体的激活/失活动力学与乳鼠心肌细胞的自发性搏动频率呈正相关。2.研究进一步将大鼠骨髓间充质干细胞并将其转染 GATA-4，与心肌细胞共培养，分离并暴露于低氧预处理的集中培养液，研究表明骨髓间充质干细胞移植可修复受损心肌,同时GATA-4对骨髓间充质干细胞膜通道电流产生不同的影响,为生物起搏的细胞移植提供新的思路。本课题瞄准国际研究热点，结合本单位的实际情况，对HCN通道进行较为深入的研究，取得一些科研成果，但未能完成最终的动物实验,探索是欠成功，在后续研究中另寻方案。