IGF2印记表达丢失促进结肠癌干细胞自我更新及干性维持的作用及调控机制研究

Overexpression of Insulin-like growth factor 2 (IGF2) in colon cancer enhances the self-renewal and metastasis of cancer stem cells (CSCs), but the mechanisms remain enigma. Loss of IGF2 imprinting is the early phase change in tumor formation. Preliminary experiment results showed loss of IGF2 imprinting occurs in CSCs of colon cancer,while maintance of IGF2 imprinting(MOI) occurs in corresponding non-stem cancer cells (nSCCs), suggesting that IGF2 LOI is a specific molecular marker of CSCs. So we put forward to hypothesis:IGF2 LOI may promote self-renewal and stem maintance of CSCs. To confirm the hypothesis, the IGF2 imprinting status will be compared in CSCs and nSCCs of colon cancer tissues and analyze the relationship between IGF2 imprinting status and the development of colon cancer. This project is proposed to characterize pathological role of IGF2 LOI of colon cancer stem cells in vitro by correctting IGF2 LOI using CRISPR/dCas9 targeting epigenetic modification system and explore the epigenetics mechanisms.If this research should be completed, it is hoped to give a theory basis for IGF2 represents a novel clinically relevant epigenetic marker to identify individuals at increased risk for colon cancer.In addition, this project will provide a new clue for designing target anti-tumor drugs for colon cancer patients.

结肠癌中胰岛素样生长因子2（IGF2）的过表达加强肿瘤干细胞(CSCs)的自我更新和转移能力，但目前机制尚不清楚。IGF2印记丢失（LOI）是肿瘤发生过程中的早期变化之一，我们的前期研究也发现结肠癌干细胞存在IGF2 LOI，而其对应的非干性肿瘤细胞（nSCCs）IGF2遗传印记维持正常，提示IGF2 LOI是CSCs特异分子标记物之一。因此，我们推测：在结肠癌组织中，IGF2 LOI促进肿瘤干细胞的自我更新和干性维持。为证实该假说，本研究将比较结肠癌组织中CSCs和nSCCs的IGF2基因及印记表达情况，分析IGF2印记状态与结肠癌发生发展的关系，进而通过CRISPR/ dCas9靶向表观遗传学修饰技术对结肠癌干细胞的IGF2 LOI进行纠正，以明确IGF2 LOI在自我更新和干性维持中的作用，并深入研究IGF2 LOI的表观遗传调控机制，为结肠癌的早期诊断及基因靶向治疗提供理论依据。

结肠癌中胰岛素样生长因子2（IGF2）的过表达加强肿瘤干细胞(CSCs)的自我更新和转移能力，但目前机制尚不清楚。IGF2印记丢失（LOI）是肿瘤发生过程中的早期变化之一，我们的前期研究也发现结肠癌干细胞存在IGF2 LOI，而其对应的非干性肿瘤细胞（nSCCs）IGF2遗传印记维持正常，提示IGF2 LOI是CSCs特异分子标记物之一。因此，我们推测：在结肠癌组织中，IGF2 LOI促进肿瘤干细胞的自我更新和干性维持。为证实该假说，本研究比较了结肠癌组织中CSCs和nSCCs的IGF2基因及印记表达情况，分析了IGF2印记状态与结肠癌发生发展的关系，通过CRISPR/Cas9靶向表观遗传学技术对结肠癌干细胞的IGF2 LOI进行了纠正，深入研究了IGF2 LOI的表观遗传调控机制和下游信号转导机制，并进一步进行了裸鼠体内实验。结果显示：结肠癌组织标本中CSCs的IGF2的表达水平明显高于nSCCs，nSCCs呈现IGF2印记保持，而在CSCs呈现IGF2印记丢失；通过建立“反义RNA介导的内源性顺式竞争(ARIC)”方法纠正了结肠癌干细胞中IGF2的异常高表达和IGF2 LOI；明确了IGF2 LOI在结肠癌干细胞自我更新和干性维持中的作用，对HCT116 CSCs IGF2靶向抑制降低了细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力，导致S期和G2/M期细胞周期阻滞和凋亡增加，降低了CSCs中CD133+细胞的数量，导致CSCs对化疗的敏感性增加；机制研究中发现 CSCs中IGF2 LOI与ICR区的DNA甲基化状态无关，IGF2靶向抑制并没有改变这一表观遗传修饰方式；IGF2启动子H3K27甲基化是IGF2印记所必需的，并与IGF2 LOI的纠正相关；染色质内环结构的消失与IGF2 LOI相关，IGF2靶向抑制与染色质内环结构的恢复相关；IGF2靶向抑制在体外抑制了PI3K/AKT和MAPK信号转导通路的激活；在裸鼠体内实验中，发现靶向IGF2在体内使移植瘤体积和质量明显降低、Ki67增殖指数显著降低和凋亡指数显著升高，IGF2靶向抑制在体内抑制了PI3K/AKT和MAPK信号转导通路的激活。本研究找到了对结肠癌干细胞IGF2遗传印记进行干预的有效环节，为结肠癌干细胞表观遗传调控提供了新的研究模式，进而为结肠癌的早期诊断及基因靶向治疗提供理论依据。