海洋卡盾藻溶血毒素组成、化学结构及产毒的环境调控机制研究

海洋卡盾藻是我国重要的有毒藻华原因种，产生的溶血毒素是导致鱼类中毒死亡的主要原因之一。然而，海洋卡盾藻溶血毒素的组成和化学结构尚未确定，且缺乏精确的定性定量检测方法。该藻在不同环境条件下毒性差异较大，环境因素对其产毒的调控机制不清。本项目拟通过室内批量培养海洋卡盾藻以提取、纯化溶血毒素，通过不同的化学分析（化合物的酸催化水解和酶催化水解等）和仪器分析手段（高分辨质谱、超导高分辨核磁共振、红外光谱和X射线单晶衍射等）对毒素纯品进行化学结构鉴定，建立该毒素的液相色谱(质谱联用)/气相色谱质谱联用等仪器检测方法和生物检测方法；在此基础上，研究不同生长阶段和不同株系海洋卡盾藻溶血毒素的组成和含量差异，弄清海洋卡盾藻产毒和环境因子（物理和化学因子）的关系。研究结果将揭示海洋卡盾藻溶血毒素产毒的关键调控因素，为该藻藻华的防灾减灾提供科学依据。

海洋卡盾藻赤潮能够造成大量鱼类死亡，对海洋生态环境和海水养殖业构成巨大威胁。海洋卡盾藻具有鱼毒性的原因主要是由于产生溶血毒素和活性氧等有毒物质。该项目围绕海洋卡盾藻的溶血毒素进行了研究，主要包括以下内容：（1）影响海洋卡盾藻产毒的环境因素。海洋卡盾藻培养5d时对数生长初期单个藻细胞的溶血活性最强，达到1.80×10-7HU/cell，此后随培养时间的增加而逐渐降低；Fe限制虽然能够显著抑制藻细胞的生长，但藻细胞的溶血活性明显增强，单个藻细胞的溶血活性达到8.37×10-7 HU/cell，为正常培养条件下溶血活性值（1.33×10-7 HU/cell）的6.3倍。另外，N限制可使藻细胞的溶血活性值达到6.67×10-7 HU/cell；Mn和P限制也能够导致藻细胞溶血活性增强。（2）海洋卡盾藻对卤虫的急性毒性效应。海洋卡盾藻的含藻培养液和除藻过滤液均对卤虫有致死作用，且前者毒性大于后者。对数生长初期的海洋卡盾藻含藻培养液的毒性作用最强，卤虫暴露在3.0×104 cells/mL藻液48h后，死亡率达到83%；对数生长后期海洋卡盾藻含藻培养液也具有较强的毒性，48h卤虫死亡率为73%；衰亡期含藻培养液毒性最弱。（3）建立了溶血毒素的高效液相色谱分析方法。实验结果表明，采用梯度洗脱的方法，海洋卡盾藻溶血毒素的粗提物在50min内取得了较好的分离，色谱条件为C8硅胶柱（4.6mm×150mm,5µm），流动相为乙腈和水，梯度洗脱（0-10min60%-80%乙腈，10-40min80%-90%乙腈，40-50min90%乙腈），检测波长为205nm和448nm，流速为0.8mL•min-1，柱温为25℃。用血红细胞法对各个主要色谱峰进行溶血活性检测显示，海洋卡盾藻香港株的溶血毒素至少含有5种成分。（4）溶血毒素组分的分离和化学结构解析。分离纯化了2个溶血毒素组分，经核磁共振和质谱分析结果表明，海洋卡盾藻具有溶血活性的两个化合物分别是棕榈酸和棕榈油酸。另外，该项目还对海洋卡盾藻产生活性氧进行了研究。该项目系统地阐明了海洋卡盾藻引致鱼类死亡的机制以及生态学效应，不仅具有重要的学术价值，而且具有很强的现实意义。