鲤疱疹病毒II型ORF25编码蛋白细胞受体的鉴定与功能研究

Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) is a major pathogen for a serious threat to crucial carp (Carassius auratus) farming and has caused huge economic losses to the aquaculture industry in China. In the same way as the most viruses, the entry of CyHV-2 into host cells requires fusion of the viruses with specific receptors on the surface of host cells. The previous study showed that CyHV-2 ORF25 encoding protein could specifically bind to gibel carp brain (GiCB) cells. However, it was unclear what cell receptor it combined with. To solve this problem, this project intends to screen the receptor of ORF25 encoding protein from the GiCB cells cDNA yeast expression library by yeast two-hybrid system. The host cell receptors of ORF25 encoding protein will be identified by yeast backcross, GST pull-down, immunoprecipitation, and immunofluorescent localization experiments. Furthermore, the function of GiCB cell receptor during CyHV-2 infection will be further elucidated by RNA interference, antibody blocking assay, and reconstitution of cell receptor in CyHV-2 non-permissive cells. This study may lay a foundation for the further investigations on the CyHV-2 infection mechanism and the innovations of vaccines against CyHV-2.

鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）是一种严重威胁我国鲫养殖的重要病原，所致疾病给鲫养殖业造成了重大的经济损失。与大多数病毒一样，CyHV-2感染宿主时，需先与宿主细胞表面的受体结合。前期研究发现，CyHV-2 ORF25编码蛋白可与异育银鲫脑组织细胞受体发生特异性吸附，但与细胞中何种受体发生吸附尚不清楚。针对这一问题，本项目拟利用酵母双杂交系统从异育银鲫脑组织细胞cDNA酵母表达文库中筛选出与ORF25编码蛋白相互作用的细胞受体；再通过酵母回交、GST pull-down及免疫共沉淀等实验，鉴定ORF25编码蛋白与细胞受体间相互作用的关系，明确与ORF25编码蛋白相互作用的细胞受体；并采用RNA干扰、抗体阻断及非易感细胞受体重建等方法，研究ORF25编码蛋白细胞受体的功能，阐明该细胞受体在CyHV-2感染过程中发挥的作用，以期为深入研究CyHV-2的感染机制以及开发CyHV-2疫苗奠定基础。

本项目通过构建鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain，GiCB)酵母双杂交cDNA文库，筛选与鲤疱疹病毒II型CyHV-2 ORF25编码蛋白相互作用的受体，再通过酵母回交、GST pull-down及免疫共沉淀等实验，鉴定ORF25编码蛋白与细胞受体间相互作用的关系，并采用RNA干扰、抗体阻断及非易感细胞受体重建等方法，研究ORF25编码蛋白细胞受体的功能，旨在为深入研究CyHV-2与宿主细胞相互作用机制奠定基础。结果显示，GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库转化效率为1.03×106 CFU/μg，滴度为1.24×106 CFU/mL，PCR扩增结果表明文库中插入片段的大小在1.5 kb左右。将表达CyHV-2 ORF25编码蛋白的诱饵菌与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交后，筛选出与ORF25编码蛋白相互作用的细胞受体RACK1；酵母回交、GST pull-down及免疫共沉淀等实验，证明了ORF25编码蛋白与细胞受体RACK1互作关系；沉默GiCB细胞中RACK1受体的表达，或利用抗RACK1受体的多克隆抗体与GiCB细胞孵育后阻断细胞受体，都能降低CyHV-2的滴度。本项目为深入研究CyHV-2的感染机制以及开发CyHV-2疫苗奠定了基础。