Sirt1及基因组不稳定性调控神经干细胞衰老的机制研究

Stem cell exhaustion and genomic instability are two major aging hallmarks. It is long presumed that DNA damage accumulates in adult stem cells and hence their ability to withstand accumulating DNA damage and maintain tissue homeostasis is a principal mechanism modulating aging. Sirt1 plays important roles in protection of the nervous system through regulating cell survival, DNA damage and repair, and cell apoptosis. In this project, we will firstly use physiological and biochemical experiments to analysis the aging phenotypes and DNA damage status of the nervous system during normal aging. Using gene expression profile analysis, we sought to define the major components and pathways underlying neural stem cell aging. Based on gene expression profiling results, we again study the main phenotypic changes of aging neural stem cell by controlling the expression of some key molecules. Meanwhile, upon the elucidation of molecular mechanisms regulating neural stem cell in normal aging, we focus on the protective function of Sirt1. We generate conditional Sirt1 knock out mouse in which Sirt1 deficiency can only happen in neural stem cells under tamoxifen administration. Combining biochemical methodologies with gene expression profiling, we shall deeply elaborate the detailed molecular regulation of Sirt1 mediated protective function in neural stem cell during normal aging. Our study will provide insights into stem cell and aging research and render effectively new targets for anti-aging therapeutics.

干细胞库的耗竭及基因组的不稳定性是机体衰老的标志，DNA损伤在组织干细胞中的积累以及组织干细胞应对DNA损伤的能力对维持组织的动态平衡进而影响组织器官的衰老至关重要，SIRT1 能够调节细胞的存活、DNA修复以及细胞凋亡，在神经系统中具有重要的保护作用。本课题拟先通过体内体外生理生化研究技术，研究自然衰老进程中神经系统的衰老表型和DNA损伤修复状况，再结合基因表达谱分析法揭示关键信号分子和通路，最后通过对关键分子的调控，再次利用生理生化方法进行表型验证。在综合阐述整个自然衰老进程中神经干细胞应对衰老以及DNA损伤修复的调控机制的同时，通过干预Sirt1，利用神经干细胞特异性Sirt1敲出小鼠，联合生理生化分析方法和基因表达谱分析，深入探讨Sirt1在神经保护过程中的具体分子机制。该项目的成功实施将为干细胞和衰老研究提供重要的理论依据和线索支撑，为抗衰老临床研究和实践提供新的有效的药物靶点。

长期以来，人们一直认为DNA损伤会在成体干细胞中积累，而成体干细胞承受DNA损伤积累和维持组织稳态的能力是调节衰老的重要机制。然而，很少有研究确定DNA损伤是否会在成体干细胞中积累并导致干细胞老化和功能衰退。在本研究中，我们通过：1.原代分离并传代培养的小鼠侧脑室下区（sub-ventricular zone，SVZ）成体神经干细胞（neural stem cells，NSCs），通过慢病毒感染的方式过表达或者敲减Sirt1，检测NSCs的细胞增殖、细胞衰老、DNA损伤与修复；2.构建NSC特异性Sirt1条件敲除小鼠，在SIRT1短期和长期缺失情况下，检测SVZ NSCs的细胞数量、增殖、凋亡、DNA损伤与修复，以及小鼠的嗅觉记忆能力；3.原代分离并传代培养野生型和SIRT1缺失小鼠SVZ NSCs，检测其增殖、衰老、凋亡、DNA损伤与修复，以及HR（同源重组，homologous recombination）和NHEJ（non-homologous end joining）修复能力；4.转录组测序野生型和SIRT1缺失小鼠SVZ NSCs，分析差异表达基因并富集信号通路，验证差异表达基因表达水平，通过干预差异基因的表达水平，检测细胞的DNA损伤应答反应。研究发现衰老过程中小鼠NSCs的DNA损伤积累减少，部分原因是通过适应性上调Sirt1并增强NHEJ修复实现的。Sirt1的缺乏会破坏这种保护优势，导致干细胞衰竭、嗅觉记忆衰退和加速衰老。随着年龄的增长，NSCs中DNA损伤积累的减少和Sirt1的上调可能代表了一种代偿机制，在衰老过程中保护干细胞免受过度的DNA损伤和其他压力从而导致衰老相关的记忆功能衰退。本研究提示老龄化的本质是多重因素和环境依赖的，后续研究需要从DNA损伤的过程和结果以及DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)两个方面来认识DNA损伤的积累，同时需要发展直接追踪和操纵DNA损伤和DDR的新方法来深入研究相关问题。