深海希瓦氏菌环境胁迫反应起始信号分子及其遗传调控

常规的实验室培养条件，对源自深海的适应寡营养、嗜冷、耐压的Shewanella piezotolerans WP3菌株可能是高度胁迫的环境。前期研究表明WP3菌株能合成较高水平的信号分子ppGpp，暗示了该菌株中存在新颖的"严谨反应"机制。本研究拟以深海嗜冷耐压菌WP3为材料，首次从其环境适应性和"严谨反应"的联系入手，研究深海微生物中ppGpp的合成与分解规律；研究WP3在压力、温度等环境胁迫条件下碳源利用、多不饱和脂肪酸合成、铁离子代谢等与适应性相关的基因受ppGpp调控的差异表达，建立受ppGpp调控的代谢网络图；探讨深海细菌如何感知压力、温度、营养等外界环境变化、继而触发一系列应激适应性反应的机理。

本课题对分离自深海沉积物的Shewanella piezotolerans WP3菌株中与环境胁迫反应相关的信号分子及其遗传调控进行了研究。在常规的实验室条件下，WP3菌株的分批次培养过程中能两次合成出较高水平的信号分子ppGpp，暗示该菌株中存在新颖的"严谨反应"机制；对WP3基因组进行生物信息学分析，发现其中存在的负责ppGpp合成与降解（relA、spoT）及其调控相关（dksA、rpoS等）基因。通过基因中断构建了relA基因中断菌株、覆盖spoT不同结构域的系列缺失突变菌株及relA spoT双基因突变株；在氨基酸耗尽的营养胁迫条件下，检测了信号分子ppGpp，结果显示ΔrelA突变菌株丧失了ppGpp合成能力，而ΔspoT3突变株中ppGpp累计甚至超过野生型的水平，这可能与ΔspoT3突变株spoT基因C端缺失了负责调节ppGpp合成及降解的功能平衡的ACT结构域有关。WP3及其突变菌株在有氧和营养丰富的培养条件下生长速率不存在明显差别，在以延胡索酸作为厌氧呼吸的电子受体条件下，ΔspoT3菌株生长较差。该结果暗示spoT基因对WP3菌株的厌氧生长过程的基因调控有重要意义。在20℃、20MPa条件下WP3及其relA、spoT基因突变菌株在生长无明显差异，在压力条件下野生型WP3菌株应激产生大量的ppGpp应对该环境胁迫。利用基因芯片发现WP3 野生菌株与ΔrelA突变株中与信号分子ppGpp调控相关的差异表达基因占到全基因组的21.44%，其中上调基因534个和下调基因526个。在多种环境胁迫条件下，SpoT负责合成ppGpp启动相应的转录调控,而SpoT的活性与铁离子浓度密切相关。可推测，SpoT负责合成ppGpp的活性增高与通过敲除维持铁稳态的关键负调控蛋白都可以增强铁离子吸收相关基因的表达。构建了铁稳态调节蛋白Fur突变株，并对其进行RNA-seq测序分析，结果显示敲除Fur的突变株中relA基因转录上调了约13倍，而spoT基因转录上调了3.38倍。此结果表明为应对fur基因突变，WP3同时需要RelA和SpoT两个蛋白用于合成信号分子ppGpp。本研究揭示了WP3中氨基酸不足、铁限制等多重胁迫效应可通过增加ppGpp信号合成进而启动多效应的转录调控得到消除，基于以上关键节点构筑的深海希瓦氏菌信号转导模型有助于解读其环境适应性机制。