甘氨酸在缺血性脑损伤中的分子作用机制研究

Ischemia stroke is a severe disease with high morbidity and mortality. However, short time-window of thrombolytic therapy and thrombectomy limits clinical application. In addition, the thrombolytic therapy and thrombectomy do not protect against cerebral damage induced by ischemia-reperfusion. Thus, early application of neuroprotective drugs is a critical strategy to improve the prognosis of stroke patients. Our recent studies show that glycine, as the co-agonist of the NMDA receptor, triggers a non-ionotropic activity of GluN2AR to confer neuroprotection. We also show that glycine increases the expression of miRNA-301a that directly binds the 3'-UTR of PTEN to suppress PTEN expression and confer neuroprotection. Our recent unpublished data show that glycine treatment reduces the infarct volume of ischemic brain independent of the channel activity of NMDA receptors. Therefore, we hypothesize that GluN2AR/miRNA-301a/PTEN signal pathway mediates glycine-induced neuroprotection in ischemic stroke. In this study, we will investigate the mechanism of Glycine/GluN2AR/miRNA-301a/PTEN signal pathway in ischemia stroke in both in vitro and in vivo experimental models. The results from this study would provide critical experimental evidence for the development of glycine as a novel neuroprotection drug in ischemia stroke.

缺血性脑卒中是最常见致死致残性疾病，现有溶栓或取栓治疗除受治疗时间窗限制外，还不能避免治疗前缺血及治疗后再灌注所引起的脑组织损伤，因此尽早（甚至入院前）给予神经保护剂治疗是改善脑卒中患者预后的重要策略之一。我们发现，NMDA 受体辅助激动剂甘氨酸通过激活NMDA受体GluN2AR亚型的非离子通道活性对抗神经兴奋性毒性，甘氨酸还可通过上调miRNA-301a直接抑制PTEN表达发挥神经保护作用。预实验结果显示，甘氨酸可通过激活NMDA受体的非离子通道活性减少大鼠脑缺血损伤面积。因此我们假设：甘氨酸通过GluN2AR/miRNA-301a/PTEN信号通路发挥脑保护作用，我们将采用离体和在体脑缺血模型揭示甘氨酸如何通过这一信号通路发挥作用及其细胞和分子机制，研究结果为将甘氨酸研发成为一种新的脑保护候选药物提供重要的理论和实验依据。

脑缺血损伤后细胞外甘氨酸含量增加，但是神经元内甘氨酸在神经疾病中的作用仍不清楚。本项目通过采用大鼠脑缺血再灌注损伤(I/R)和大鼠脑皮层氧葡萄糖剥夺(OGD)实验模型，检测神经元内甘氨酸的改变及其作用。我们发现大鼠I/R后神经元内甘氨酸减少。减少神经元内甘氨酸可促进OGD损伤后的神经元死亡，而增加神经元内甘氨酸可减少OGD诱导的神经元死亡。然而，我们发现甘氨酸具有低血脑屏障通透性。为了开发一种允许甘氨酸穿过血脑屏障的方法，我们设计了一种含甘氨酸的三肽:甘氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸(GCF)。苯丙氨酸用于增加GCF的渗透性。半胱氨酸与甘氨酸和苯丙氨酸结合使GCF能够裂解，因为GCF中的两个键在神经元中是可以裂解的。我们证明GCF通过寡肽转运体PhT1进入血脑屏障。GCF选择性分布于缺血区，局限于缺血神经元。静脉注射GCF，而不是稳定形式的乙酰-GCF，可导致神经元内甘氨酸的升高，并对缺血性中风动物提供神经保护作用。. 神经元内甘氨酸的合成代谢和摄取在神经疾病中的作用尚不清楚。细胞内甘氨酸的水平受丝氨酸羟甲基转移酶2 (SHMT2)和甘氨酸转运体1 (GlyT1)的调控。我们发现大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元SHMT2的表达减少。受损神经元中转录NRF2/ATF4信号的抑制介导SHMT2的下调，从而导致神经元内甘氨酸的减少。大鼠脑缺血再灌注损伤后，伴随着SHMT2表达的改变，GlyT1膜表达降低。我们发现，缺血诱导的网格蛋白介导的GlyT1内吞作用有助于损伤神经元内甘氨酸的减少。我们的结果表明，抑制SHMT2和GlyT1可促进氧葡萄糖剥夺(OGD)神经元细胞的死亡。在受损神经元中补充甘氨酸可减少OGD损伤后神经元的死亡。已知细胞外甘氨酸在脑缺血再灌注损伤后增加。本研究揭示了脑缺血后神经元内甘氨酸的意外减少及其潜在机制。这些结果提示了一种潜在的神经保护方法，即在缺血神经元中补充甘氨酸可以起到脑保护作用。