基于RNA-Seq和iTRAQ 技术解析铁皮石斛种子接菌共生萌发的分子机制

Dendrobium officinale is one of the endangered Orchidaceae medicinal plants. The seeds is of huge quantity but can not germinate independently and their germination must rely on the symbiotic with fungi. The molecular mechanism of Dendrobium orchid seeds germination induced by fungi remains unclear, although many scientists focused on the point. Supported by the NSFC youth project, we have screened the Tulasnella that promote germination of Dendrobium orchid, settled up a dual culture system of symbiotic germination, examined the ultrastructural changes in the process of symbiotic germination. Based on the previous studies, we hypothesize that "in the process and the establishment of seed symbiotic relationship, the fungi and their components activate the signal transduction pathways in seed germination of the host or involve in these pathways by hormone or other signals, and then start the seed germination". This project aims to explore the different profile of transcriptome and proteome between asymbiotic and symbiotic germination in different germination levels using RNA-Seq and iTRAQ, and then to screen key genes and proteins involved in symbiotic germination, to investigate whether these candidate genes and proteins are involved in the hormonal regulation of seed germination or not, to interpret the mechanism of symbiotic germination. This study will supply foundation for comprehensive understanding the molecular mechanism of orchid seed germination, and theoretical references for recovering the wild resources of Dendrobium and other orchids plants using symbiosis.

铁皮石斛是濒危兰科药用植物，其种子量巨大但自然状态下必须依赖共生真菌才能萌发，真菌诱导石斛等兰科种子萌发的分子机制尚不明确。在国自然青年项目支持下，我们筛选到了促进铁皮石斛种子萌发的胶膜菌属真菌，建立了共生萌发的双重培养体系，研究了共生萌发过程的细胞超微结构变化。基于前期研究我们假设“真菌在与种子建立共生关系过程中，通过激素等信号激活宿主种子萌发信号通路或与其交互作用，启动种子萌发”。本项目拟对铁皮石斛无菌萌发和接菌共生萌发不同阶段的样品进行RNA-Seq和iTRAQ组学分析，采用生物信息学方法筛选参与共生萌发的关键基因和蛋白，通过敲低或过表达植物来源候选基因、异源转化真菌来源基因验证其参与激素等种子萌发信号通路或与之交互作用，阐释共生真菌在种子萌发中的作用及途径。本研究将为全面解析真菌促进兰科种子萌发的分子机制奠定基础，为科学应用共生技术推进石斛等濒危兰科药用植物资源再生提供理论参考。

铁皮石斛是兰科名贵药用植物，其种子量巨大，但自然状态下必须依赖共生真菌才能萌发，真菌诱导石斛等兰科种子萌发的分子机制尚不明确。本项目对铁皮石斛无菌萌发和接菌共生萌发不同阶段的样品进行了RNA-Seq和iTRAQ组学分析，获得了大量的数据。通过数据分析，明确了铁皮石斛种子接菌共生和无菌萌发在种子萌发初期有着相似的萌发途径。鉴定了32个与种子接菌共生萌发相关的且在转录及蛋白水平上共表达的关键候选蛋白，初步揭示了铁皮石斛种子与真菌共生互作的分子机制即接种真菌促进了石斛植物体中与碳水化合物和脂代谢相关基因的高表达，提高了种子萌发过程中对内源营养物质的利用效率。同时，为进一步明确真菌与石斛种子互作过程中植物激素尤其是赤霉素的作用，本项目定量分析了石斛种子接菌共生萌发过程中5种内源激素含量。结果表明，赤霉素（GA3）含量在铁皮石斛种子无菌和共生萌发中无显著差异，但是赤霉素与脱落酸（GA3/ABA）比值在种子共生萌发不同发育阶段均高于无菌萌发，并且在4级阶段显著高于无菌萌发（P<0.05）；生长素（IAA）含量在接菌共生萌发的种子中显著高于无菌萌发组，并且在3级阶段共生组含量最高（25.9064 ng/g.FW），在一定程度上解释了接菌共生萌发组相对无菌萌发而言具有较高萌发率和较快萌发速率。实验进一步考察了外源添加不同浓度的赤霉素（0、0.05μM、0.1μM、1μM）对铁皮石斛种子无菌和接菌共生萌发过程的影响，结果表明高浓度的赤霉素会通过抑制菌根共生关系的建立，从而抑制种子萌发。赤霉素合成代谢及信号转导途径相关基因（如DoGA2ox, DoGA20ox, DoGA3ox和DoKO）、公共共生信号途径基因如DoNSP2及钙信号相关基因DoCDPK26以及共生特异性基因（如DoHAL,几丁质酶编码基因）均响应外源不同浓度GA3的变化，表现在高浓度GA3(0.5μM、1μM)处理下，上述基因受真菌诱导表达发生激增变化。此外，从共生萌发的铁皮石斛种子中克隆到1个参与GAs信号转导的基因DoSCL3，并通过qRT-PCR技术验证该基因在未萌发、接菌共生和无菌萌发不同阶段的表达模式推测。这些研究结果为全面解析真菌促进兰科种子萌发的分子机制奠定基础，为科学应用共生技术推进石斛等濒危兰科药用植物资源再生提供理论参考。