一种新发现的柔嫩艾美耳球虫病毒分子特性及转染载体构建

柔嫩艾美耳球虫病是严重危害养鸡业发展的重要疾病之一，柔嫩艾美耳球虫病毒是申请者新发现的一种存在于柔嫩艾美耳球虫体内的病毒，新病毒的发现给该病研究增添了新内容，提出了新课题。.本项目针对目前该病毒的分子特性尚不清楚以及柔嫩艾美耳球虫研究中缺乏理想的基因转染载体等问题，拟通过对新病毒核酸种类分析、RNA依赖RNA聚合酶活性检测，以期确定新发现柔嫩艾美耳球虫病毒的分类地位；通过全长cDNA测序阐明其基因背景；通过病毒体内外感染试验、与虫体毒力相关性试验等研究弄清病毒的致病性及对虫体毒力的影响；在此基础上利用该病毒序列构建柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体，为柔嫩艾美耳球虫的基因表达调控、基因功能研究等提供技术支撑。必将丰富原虫病毒的研究内涵，对于重新认知柔嫩艾美耳球虫这一重要病原及该病防治具有重要意义。

通过对柔嫩艾美耳球虫病毒的形态观察、全基因组破译、转染球虫载体的构建等系列研究，结果发现柔嫩艾美耳球虫内存在不同的dsRNA病毒EtRV1和EtRV2，病毒外观均呈球形，二十面体，无囊膜。EtRV1直径38nm，EtRV2为30nm。EtRV1核酸为1.4kb、2.4kb和3.6kb，EtRV2为6.0kb。EtRV2体内外感染试验表明接毒雏鸡组织、鸡胚成纤维细胞和鸡胚未发现病变，未检测出病毒基因，初步表明该病毒不能感染雏鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞。病毒与虫株毒力相关试验表明含病毒株均具有较强的毒力，但尚不能确定虫体毒力与病毒有关。利用简并引物、smart RACE等技术联合破译EtRV2全基因组（6006bp）。全基因组含2个ORF分别编码衣壳蛋白和RdRp酶，2个ORF间有一个overlap (UGA/UG)，2个非编码区5'UTR和3'UTR。EtRV2具有Totiviridae病毒家族的特性，属于这个家族的一个新成员。BLASTp分析显示EtRV2与Genbank中其它病毒序列同源性较低。系统发育分析它和真菌病毒同属于Victorivirus属，但又与真菌病毒在不同分支，建议一个新的亚属Eimeriaviruses。利用病毒序列特征构建T7启动子和EGFP融合载体，体外转录后电穿孔导入虫体内，镜下观察到绿色荧光。这是首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并破译全基因组和利用病毒序列建立外源基因在虫体内表达的载体。