两种生防真菌转录因子调控的胁迫响应机制比较研究

以害虫生防真菌球孢白僵菌和绿僵菌为对象，研究揭示其胞内重要转录因子BbMsn2和MaMsn2对不同环境胁迫的生理响应及其代谢调控机制。首先，克隆目标基因BbMsn2和MaMsn2并分别构建其敲除载体，运用农杆菌介导的转化方法获得目标基因的缺失菌株；其次，研究敲除菌株在各种压力胁迫下的生物表型变化和侵染力变化；第三，采用数字基因表达谱的方法分析目标基因在各种胁迫下表达基因的差异，探明BbMsn2和MaMsn2基因调控的下游基因和调控机制；最后，通过胁迫响应表达谱分析和基因重组技术，构建抗逆力和侵染力显著增强的重组菌株。本项目的实施和完成将首次阐明丝孢类生防真菌转录因子的生物学功能，重点揭示其对生防真菌抗逆性状的贡献及其调控机制，为从功能基因组学、转录组学和蛋白组学进一步研究真菌抗逆机理和生防菌剂改良奠定基础。

球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌是生防真菌的典型代表，其分生孢子制剂的环境稳定性是制约菌剂商品化开发和应用的关键。本项目围绕抗逆胁迫响应的主题，以球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌为对象，以重要的农业害虫斜纹夜蛾，黄粉虫和大蜡螟为靶标，解析了转录因子Msn2和14-3-3保守蛋白在生防真菌抗压力胁迫下的响应机制，初步形成了丝孢类生防真菌转录因子在环境胁迫下生理学响应的技术研究和理论，通过转录谱数据挖掘出关键基因构建了胁迫耐受力和侵染毒力显著增强的重组菌株，从而完成了立项的研究任务。本项目取得的主要成果如下：（1）以球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌转录因子Msn2（Bbmsn2和Mrmsn2）为模型，运用农杆菌介导法对Bbmsn2和Mrmsn2基因成功实施了敲除和回补，用所获敲除株与回补株及野生株进行表型变化的实验和分析，结果表明，Msn2在球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌产孢、多胁迫响应及侵染力的调控中起着重要作用。（2）采用高通量转录组数据分析（RNA-Seq）的方法，解析Msn2在热和氧化胁迫响应下调控抗逆性状的内在机制，揭示了在氧化和热胁迫的条件下球孢白僵菌中Bbmsn2缺失导致了9%和3%的基因差异的表达，而Mrmsn2的缺失导致罗伯茨绿僵菌6%和15%的基因差异表达。聚类分析发现，两种胁迫下均显著下调的基因参与细胞胁迫响应，碳水化合物和蛋白质代谢，解毒过程，信号转导，胞壁完整性和转录调控，这为解析Msn2调控生防真菌抗逆性状的机制提供了强有力的理论依据。(1)和(2)的成果已发表于Fungal Genetics and Biology。（3）分析胁迫响应转录表达谱，挖掘出抗逆性状的关键因子14-3-3蛋白（编码基因：Bmh1/2），研究其生物学表型，发现它们参与细胞生长发育、菌丝形态、产孢节律和产孢量、多胁迫响应及侵染力等重要生物学性状的调控，在菌丝和分生孢子抵抗不同来源的压力胁迫反应中均发挥显著作用，且具有累加效应，是影响菌株生长发育和抗逆性状及其毒力的关键因子。结合RNA-Seq分析胁迫响应的机制，发现在渗透胁迫下Bmh1和Bmh2缺失导致了6%和4%的基因差异的表达，氧化胁迫下导致3%和6%的基因差异表达，这些基因参与转录调控、细胞结构的形成、细胞防御和毒力、解毒过程，信号传导和碳水化合物合成，为解析14-3-3蛋白调控生防真菌生长发育和抗逆性状提供了理论依据。该部分成果已发表于En