粗糙脉孢菌介导的松材线虫喂食法RNAi体系的建立及基因功能研究的应用

松材线虫能引起松树大片枯萎而死，已引起国家林业局高度重视，但目前其致病机理尚不明确，基因功能方面的研究还很薄弱。RNAi技术已广泛用于线虫基因功能的研究，但松材线虫中已有的RNAi方法都存在成本高和干扰效率低的问题，急需建立高效且操作简便的RNAi新体系。我们前期研究发现模式生物粗糙脉孢菌能培养松材线虫，在此基础上我们拟建立脉孢菌饲喂松材线虫的体系、获得脉孢菌的dsRNA表达及转化技术、建立粗糙脉孢菌介导的喂食法RNAi体系，以提供低成本、高效的松材线虫RNAi研究新手段；同时，利用已公布的其它线虫的基因组序列，Blast分析松材线虫的EST库，获得大量松材线虫寄生致病及发育等相关的基因作为RNAi靶基因，然后大量构建能表达靶基因dsRNA的脉孢菌，喂食松材线虫进行RNAi，评价RNAi效果，应用于松材线虫重要基因功能的研究，为研究松材线虫的致病机理及防治策略提供重要的理论基础。

松材线虫能引起松树大片枯萎而死，但目前其基因功能方面的研究还很薄弱。RNAi技术已广泛用于线虫基因功能的研究，但松材线虫中已有的RNAi方法都存在成本高和干扰效率低的问题，本项目尝试建立基于喂食法的RNAi新体系，以提供低成本、高效的松材线虫RNAi研究新手段。研究内容包括建立脉孢菌饲喂松材线虫的体系、获得脉孢菌的dsRNA表达及转化技术、建立粗糙脉孢菌介导的喂食法RNAi体系。在前期研究基础上，我们建立了稳定的粗糙脉孢菌饲喂松材线虫的培养体系，优化了接种浓度、培养温度等条件；利用已公布的其它线虫的基因组序列，Blast分析松材线虫的EST库，获得200多条松材线虫寄生致病及发育等相关的基因作为RNAi靶基因；从中选取了6个作为实验对象，构建了dsRNA表达载体；获得了粗糙脉孢菌的Dicer I和Dicer II敲除突变株Dicer1KO-Dicer2RIP ，使具有切割dsRNA功能的Dicer酶失活，并以该突变株为受体，将dsRNA表达载体进行转化，采用PCR的方法验证获得ptr-2阳性菌株；通过对虫卵进行消毒再进行孵化的改进，获得了制备无菌松材线虫的方法；以ptr-2粗糙脉孢菌重组菌株喂食松材线虫，发现松材线虫繁殖量差异不显著；qPCR分析结果表明粗糙脉孢菌重组菌株为食的松材线虫的ptr-2表达量与对照相比无明显差异；初步以粗糙脉孢菌的类胡萝卜素合成基因突变株检测了dsRNA的合成情况，菌株未能由白转黄，说明dsRNA可能未表达。