择瘤繁殖并表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒检测循环肿瘤细胞

Blood stream dissemination is the main way for melignant tumor metastasis. Detection of CTCs would facilitate studying metastatic mechanisms, making treatment plan and proventing tumor progress. Sofar, many methods have been developed for the detection of CTCs, but very few has advanced into clinical application. We have developed a new method using tumor-selective replicable HSV expressing GFP (HSVGFP) for CTC detection. The spiked tumor cells in healthy donor's PBMC can be detected at a detecting level of 2-3 cells/ml blood. In addition, the single tumor cell separated with this method was verified by genomic sequencing analysis. Our new method only detect life CTCs, as HSVGFP only replicate in life cells. In this application, we propose to investigate the relationship between CTC number and tumor stage and prognosis. It is expected that our study will generate the important data to be used in tumor stage analysis, clinical treatment protocol and prognosis judgement.

血循播散是恶性肿瘤向远处转移的主要途径。检测外周血中的循环肿瘤细胞（CTCs），了解肿瘤细胞血循播散的规律，有助于掌握治疗时机，防控病情恶化，提高治疗效果。已有不同检测方法的报道，如流式细胞术、磁珠抗体分离术、实时RT-PCR等，尚不适于临床常规应用。 我们探索一种快捷简便的新方法，采用择瘤繁殖并表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒（简称HSVGFP，已申请专利）检测循环肿瘤细胞。实验表明，向志愿者外周血中加入的人肿瘤细胞，能被本法有效地检出；灵敏度达2-3个瘤细胞/ml外周血的水平。本法分离的加入外周血中的单个肿瘤细胞经序列分析得以证实。病毒仅在活细胞内表达GFP，故本法的一个重要优点为检测活的肿瘤细胞。 立题的科学问题：本法检测临床CTC的细胞数与肿瘤疾病进程及预后的相关性？为临床分期、治疗方案及预后判断提供科学依据。

血循播散是恶性肿瘤向远处转移的主要途径。检测外周血中的循环肿瘤细胞（CTCs），了解肿瘤细胞血循播散的规律，有助于掌握治疗时机，防控病情恶化，提高治疗效果。已有不同检测方法的报道，如流式细胞术、磁珠抗体分离术、实时RT-PCR 等，尚不适于临床常规应用。我们探索一种快捷简便的新方法，采用择瘤繁殖并表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒检测循环肿瘤细胞。实验表明，通过体外模拟实验的优化，使该检测方法的检测灵敏度及特异性均达到70%以上，与现有所用的CTC检测方式有所提高。通过单细胞测序技术，验证检出的CTC的准确性。通过多瘤种，多样本的对比检测正常人及肿瘤病人血中CTC，该检测方法可以有效地区分肿瘤患者和非肿瘤患者。在检出数在3的时候，灵敏度特异性均可以达到80%以上，结果显示，该检测方法在胃癌及其他多种实体瘤中具有很强的临床检测效能。选取40例肺癌化疗患者样本，对比CellSearch检测结果与病毒载体检测技术平台，结果显示，该项目建立的CTC检测技术可以更好地反应真实的临床状态，具有更高的临床检测效能。该方法与病理学相比较，病理学明确发生转移的病例，该方法具有极高的阳性检出率；而在病理学无法判断发生转移的病例中，该方法同样有阳性检出，并与已知的现有临床现象相吻合，说明该方法同样对微小残留有较好的检出率。此外，本项研究的结果显示本方法可以有效的对放、化疗的疗效进行动态检测。该检测方法，有望形成检测试剂盒，可以实现辅助临床CTC的诊断，具有较强的临床应用潜力。