花生种子凝集素的纯化、克隆、结构与功能研究

本课题纯化了花生种子中一种凝集素，对其进行了性质分析、质谱鉴定及表达特征分析，结果表明，这种凝集素的分子量为29KD，对乳糖具有强烈的结合特性；pH为5.0-11.0范围内较稳定，经55℃保温10min后活性完全消失；能够凝集胃癌和肝癌肿瘤细胞；在花生的生长初期这种凝集素的存在部位是子叶和根。本项目拟在前期工作的基础上，克隆该凝集素的基因，研究它在病虫害入侵后的表达变化，研究它在不同品种、不同时期、不同生长条件下的表达特点，阐明其生理功能；构建表达载体，活化重组蛋白；利用表面等离子共振仪、荧光光谱、核磁共振仪等手段研究凝集素与配体（抗体）的作用位点和方式，阐明其多糖识别结构域的结构及作用方式。解析花生中凝集素的结构和功能，为阐明凝集素与配体（或生物大分子）的作用模式奠定基础，花生品质改良提供新的思路，为凝集素在肿瘤诊断和治疗过程中的进一步应用提供依

花生是我国重要的油料作物、经济作物和出口创汇作物。本研究利用乳糖结合的.琼脂糖层析柱通过亲和层析从花生种子中纯化了一种凝集素，命名为为AHL。AHL对唾液酸酶处理后的人的A/B/O型血细胞具有较强的结合特性；MALDI-TOF-TOF MS分析结果显示AHL与编号gi|1942899的花生凝集素A蛋白是同一种蛋白质；AHL对一些能引起花生疾病的革兰氏阴性菌及真菌孢子有结合特异性；我们研究了不同花生组织和花生生长不同时期的AHL表达特点，在检测的6个花生品种中鲁花12号AHL的表达量最高；将AHL基因引入大肠杆菌表达载体中，获得了AHL的重组表达蛋白，利用纯化的重组表达蛋白制备了AHL的多克隆抗体；利用Western-Blot技术实现了多克隆抗体与纯化天然蛋白的杂交；构建了带有花生凝集素AHL基因与报告基因YFP的融合蛋白的表达载体，通过瞬时表达试验分析表明凝集素基因AHL基因定位于细胞壁和细胞膜；利用荧光发射光谱研究凝集素与其配体半乳糖的相互作用；利用软件对花生凝集素蛋白（AHL）的3D结构进行模拟，并对其与配体作用方式进行分析。