孕酮在家鸡蛋壳钙化形成中的作用机理研究

研究表明家鸡蛋壳中钙的形成由子宫细胞分泌，孕酮在调控子宫细胞中钙的波动时起一定的作用，而其在蛋壳钙化过程中的作用机理目前还不清楚。为解释蛋壳钙化形成的分子机理，本研究采用实时定量 PCR、扫描电镜和血液生理生化指标测定等方法对形成蛋壳钙化的相关基因、蛋壳超微结构和血液中钙离子和孕酮的含量进行研究；同时构建Cabp-d28k基因启动子的荧光报告载体，转染体外培养的子宫内膜细胞，通过在培养细胞中添加孕酮，测定载体中荧光素酶的活性变化来确定孕酮对Cabp-d28k基因启动子转录起着"开关"的作用；并结合在产蛋过程中蛋鸡体内注射孕酮及拮抗剂对产蛋时间和蛋壳结构的影响，分析孕酮在蛋壳钙化时所起的作用，从而揭示蛋壳钙化时起重要调控作用的因子，为阐明蛋壳钙化形成的细胞分子机理提供理论依据。

蛋壳形成于输卵管子宫部，孕酮对蛋鸡的产蛋行为发挥着重要作用。本课题对孕酮在蛋壳钙化形成时作用机理进行了深入研究。.1、产蛋高峰期的蛋鸡，蛋进入输卵管子宫部的不同时间点取蛋壳、子宫和血液，X射线能谱仪、扫描电镜测定蛋壳元素含量，内、外表面和横断面的超微结构；测定血钙含量和孕酮浓度；检测子宫部Cabp-d28k、Ca2+-ATPase、CA、PGR基因的表达规律。结果表明：蛋壳形成过程中钙沉积量逐渐增多，蛋进入子宫前1h到进入子宫5h钙沉积最多，之后钙沉积量减少；蛋壳形成过程中横断面变厚，椎体层逐渐形成，外表面裂隙的数量、深度及内表面的突起减少，纤维层的致密性、有序性下降；Cabp-d28k、Ca2+-ATPase表达量在蛋进入子宫15h达到最大，产蛋后逐渐下降，PGR呈先上升后下降的变化规律，CA在蛋进入子宫5h表达量最大，随后逐渐下降。.2、孕酮及其受体拮抗剂处理蛋鸡，蛋进入子宫不同时间点和不同处理组取样，结果表明：两种处理都能够增加蛋壳厚度和钙沉积；孕酮处理后蛋壳强度高于对照组，而拮抗剂处理则低于对照组，说明孕酮不仅能够增加蛋壳厚度，而且可以增强蛋壳强度，而拮抗剂组虽然增加了蛋壳厚度，但是蛋壳强度减弱；孕酮组蛋壳钙元素含量高于对照组（P＜0.01），拮抗剂组蛋壳钙元素含量高于对照组（P＜0.05）；孕酮抑制血钙含量升高，并对Cabp-d28k、Ca2+-ATP、CA表达起负调控作用；产蛋时间孕酮组大于对照组（P＜0.01），拮抗剂组小于对照组（P＜0.05）。.3、培养子宫内膜上皮细胞和基质细胞，免疫组化鉴定呈阳性。添加孕酮促进基质细胞的增殖(P<0.05)，孕酮+雌激素促进上皮细胞的增殖（P<0.05）；雌激素+孕酮对培养细胞中Cabp-d28K表达量有促进作用，孕酮单独作用对Cabp-d28k表达量的影响不显著；Cabp-d28k分布于子宫部黏膜上皮的纤毛上皮细胞游离端，免疫组化呈棕黄色，基底层也有少量分布；Cabp-d28k启动子中有与经典孕激素应答元件（PRE）相似的序列，Cabp-d28k表达变化与PR非常相似，尤其是在蛋鸡产蛋过程中体内注射孕酮后Cabp-d28k和PR基因表达量明显下降，分析认为孕激素与PR结合，分泌某种或某些因子抑制Cabp-d28k的表达，同时也表明孕酮对二者表达均起负调控作用，进一步揭示了孕酮在蛋壳钙化形成时的作用机理。