宇佐美曲霉木聚糖酶耐热/耐碱性的分子改造

木聚糖酶的应用领域与其工业应用特性(如耐热、耐强酸或强碱等)密切相关。本项目通过克隆具有自主知识产权的宇佐美曲霉中编码木聚糖酶的全部基因，与源于其他微生物的具有耐热/碱的木聚糖酶基因进行比对，获得影响热/碱稳定性的优势基因并进行整合构建杂合木聚糖酶；同时采用计算生物学方法确定与热/碱稳定性关联的氨基酸(或氨基酸二联体)及其位点，进行定点突变，以获得热/碱稳定性显著提高的突变酶。预期研究结果进一步丰富对真菌木聚糖酶的结构与功能关系的认识，为制备具有工业应用价值的耐热/耐碱性木聚糖酶提供新的技术途径。

项目克隆了宇佐美曲霉 (Aspergillus usamii) 10和11家族木聚糖酶(AusXyn10A和 AusXyn11D)基因，并在毕赤酵母 (Pichia pastoris) GS115中成功表达，并在此基础上利用计算机辅助设计通过N/C端片段替换、二硫键添加以及点突变对该酶的热稳定性和pH适应性进行了理性/半理性改造研究，主要研究结果如下： (1)构建了一种蛋白天然N端表达质粒pPIC9KM，并应用该质粒将AusXyn10A成熟肽的编码基因整合到P. pastoris GS115基因组中，获得的高拷贝重组子产酶活性高达100.8 UmL-1； (2)将嗜热木聚糖酶TmxB中片段替换AusXyn10A C端的A300NA302，构建并表达重组酶reAusXynCRC1，重组酶在50℃下的半衰期较原酶的有明显的降低；在AusXynCRC1的基础上引入突变H13L和A12K，获得突变酶AusXynCRC2，该突变酶的比酶活较原酶提高38 %，在50℃下保温10 min后残余相对酶活提高到40 %。(3)将嗜热木聚糖酶TaXyn10 N端区域的氨基酸片段替换AusXyn10A相对应的片段，构建并表达N端片段替换酶AusXynCRN1，替换酶的最适温度与原酶reAusXyn10A一致，在55℃下半衰期由6.9 min提高到了8.0 min；在AusXynCRN1中同时引入突变S286G和H288F，获得的替换突变酶reAusXynCRN2的比酶活为8,129 Umg-1，较原酶reAusXyn10A提高49%，最适温度为60℃，较原酶提高了10℃，在55℃的半衰期由6.9 min提高到了72 min，是原酶的10.4倍； (4)分子动力学模拟预测结果，筛选出RMSD值低于原酶AusXyn10A的二硫键突变酶D7C/G42C和S246C/A297C并分别在P. pastoris中表达；突变酶的最适温度较原酶提高了5℃，在50℃保温60 min残余酶活较原酶有明显提高，表明246-297位二硫键的添加能够大幅提高酶的热稳定性； (5)以AuXyn11A 拇指结构基因替换碱性木聚糖酶EvXyn11TS拇指结构基因，获得杂合酶基因 Evxyn11A。杂合酶的最适 pH 为 5.5，较原碱性木聚糖酶 EvXyn11TS的最适 pH 降低 1.0.