新型耐热酸性β-甘露聚糖酶的发掘、分子改造及其作用机理

β-Mannanase is a kind of important glycosyl hydrolytic enzymes, which has been wildly used in various fields such as feed, food, and paper, especially in feed industry. Due to the relative lateness of research in this field, the β-mannanases with high quality that suit for various industries are still lack in domestic. Exploitation of biodiversity to provide microorganisms that produce β-mannanases well suited for their diverse applications is considered to be one of the most promising future alternatives. The thermostable β-mannanases usually show good thermostability at relatively high temperatures and posses potential applications. The proposal will continue to isolate the excellent microorganisms producing thermostable and acidic β-mannanases, clone and express novel β-mannanase genes, or modify the previously reported β-mannanase genes at our lab. The rational design, directed evolution, and the fusion protein technology will be used to obtain the mutant β-mannanases with excellent characteristics such as good thermostability, high substrate affinity, acidic tolerance and protease tolerance etc. Also, the action mechanism of various β-mannanases after molecular modification will be investigated. The results will not noly provide more types of β-mannanases, but will also develop a method for direct molecular modification of enzymes, as well as promote the applications of β-mannanases in feed industry, etc.

β-甘露聚糖酶广泛应用于饲料、食品、造纸等领域，尤其在饲料领域具有重要的应用价值。由于我国相关研究起步较晚，基础研究相对薄弱，目前国内还缺乏高效专一的高品质β-甘露聚糖酶制剂。不同微生物所产的β-甘露聚糖酶性质不同，基于应用需求研究适合不同行业应用的新型β-甘露聚糖酶是将来的发展趋势之一。耐热β-甘露聚糖酶在较高温度下稳定，具有很大的工业应用潜力。本项目拟筛选产耐热酸性β-甘露聚糖酶的优良微生物，克隆表达新型β-甘露聚糖酶基因，或以已有的耐热β-甘露聚糖酶基因为出发点，采用理性设计、定向进化和融合蛋白技术等方法进行酶分子定向改造，开发具有热稳定好、底物亲和力强、酸性条件稳定以及对蛋白酶有抗性等特性的β-甘露聚糖酶，并研究系列改造后甘露聚糖酶的作用机理。本项目的实施不仅丰富β-甘露聚糖酶的品种，而且有望开辟一条酶分子定向改造的方法，同时也为β-甘露聚糖酶在饲料等行业应用提供理论依据。

随着酶制剂行业的发展，β-甘露聚糖酶广泛应用于饲料、食品、生物乙醇等领域。但我国相关研究起步较晚，行业基础薄弱，缺乏高效的β-甘露聚糖酶制剂。.项目组从自行筛选的米黑根毛霉CAU432中扩增出一个GH5家族β-甘露聚糖酶基因（RmMan5A），并成功在大肠杆菌中表达。RmMan5A的最适pH为7.0，在pH 4.0-10.0保持稳定；最适温度55℃，在55℃以下保持稳定。此外，该酶还表现出较高的比酶活力和优良的水解特性。.为了揭示RmMan5A的催化机理，解析了该酶的分子结构。该酶呈现典型的(α/β)8-TIM桶结构，每个分子由9个α-螺旋和12个β-折叠链组成。为增加其在食品、饲料领域的应用范围，对其进行定向进化，筛选得到β-甘露聚糖酶突变体（mRmMan5A）。与RmMan5A相比，mRmMan5A的最适pH改变为4.5，最适温度提高至65℃，同时保留了其他一些优良特性，如高比酶活力以及水解特性。.为提升这两种β-甘露聚糖酶的应用潜力，降低成本，将两个基因（RmMan5A和mRmMan5A）分别导入毕赤酵母GS115中。经5-L发酵罐发酵168 h后，RmMan5A和mRmMan5A的表达水平分别达到85200和72626 U/mL。是已有报道中的最高水平。.从米黑根毛霉CAU432中得到第一个真菌来源的GH5家族β-甘露糖苷酶基因（RmMan5B），并成功在大肠杆菌中表达。RmMan5B的最适pH为5.5，在pH 5.0-9.5保持稳定；其最适温度60℃，在55℃以下稳定。该酶表现出较强的转糖苷活性和逆向水解能力。其结构与RmMan5A相似，RmMan5B呈一种典型的(β/α)8-桶结构，但是其催化位点被一些更长的loop修饰。为了研究GH5家族β-甘露糖苷酶的生化性质，从伞枝犁头霉D1中得到β-甘露糖苷酶基因（AcMan5），并在大肠杆菌中表达。AcMan5的最适pH为5.5，且在pH 4.0-10.5保持稳定；最适温度60℃，在60℃以下稳定。较之RmMan5B，该酶的水解活性有所降低，但其转糖苷活性和逆向水解能力更强。在甘露寡糖合成方面具有更大的应用潜力。.本项目的实施丰富了β-甘露聚糖降解酶的种类，并拓展了其在食品、饲料等行业中的应用范围。通过对两种酶分子结构的解析，揭示了其催化机理，为两种酶的分子改造提供理论依据。