内源性硫化氢在硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤中的保护作用及其机制研究

Endogenous hydrogen sulfide (H2S) has a variety of physiological functions including anti-oxidation, anti-inflammation, and protecting tissues. CSE, The Synthesizing enzyme of Endogenous hydrogen sulfide in lung) Applicants found beryllium sulfate can induce pulmonary inflammation and oxidative damage on rats, and beryllium sulfate can induce endogenous hydrogen sulfide reduction in rats plasma and lung tissue, lung injury is aggravating after inhibition of endogenous hydrogen sulfide generated . It suggests that H2S is related to the pathogenesis of berylliosis. Models of human embryonic lung cell and SD rats exposed to beryllium sulfate will be built to observe the changes of H2S level in pneumonocyte, the expression and activity of cystathionine-γ-lyase (CSE) will be detected; To explore the effects of pneumonocyte damage induced by beryllium sulfate after changing the generation of H2S，the propargylglycine (PPG, inhibitor of CSE), sodium hydrosulfide (NaHS, donor of H2S), CSE overexpression, or CSE RNAi will be use separately; LY294002(inhibitor of PI3K),Nrf-2 siRNA and HO-1 siRNA will be employ to explore the mechanism of pneumonocyte injury regulated by endogenous H2S through mediate the pathway of PI3K/AKT/Nrf-2/HO-1. From the above, we can elucidate the regulatory effects and mechanisms of CSE/H2S on pulmonary injury induced by beryllium sulfate, which can provide a new strategy to prevention berylliosis.

肺内硫化氢主要由胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化生成。申请者前期发现硫酸铍可致大鼠肺部炎症、氧化损伤、硫化氢含量减少，肺组织PI3K及p-Akt蛋白表达下调，CSE 的抑制剂炔丙基甘氨酸（PPG）下调PI3K及p-Akt蛋白表达且加重肺部炎症，硫氢化钠（NaHS）--H2S供体则相反，提示硫化氢与铍化合物肺毒性有关。故提出“内源性H2S在硫酸铍致肺细胞炎症反应、氧化损伤中有保护作用”的设想。拟建立硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤模型，观察肺细胞内硫化氢含量、CSE活性和表达；探讨PPG、NaHS干预、转染CSE基因、CSERNAi等手段改变硫化氢生成对硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤的影响；用抑制剂及siRNA技术探讨PI3K/AKT/Nrf-2/HO-1通路在硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤中的作用。本课题可阐明CSE/H2S在硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤中的保护作用及机制，为铍病防治提供新策略。

铍及其化合物能致急性化学性肺炎和慢性铍病，慢性铍病是一种进展性、原因不明的以肺部肉芽肿炎症为主的全身性疾病。气体信号分子硫化氢有抗氧化抗炎作用，肺内主要由胱硫醚-γ-裂解酶催化生成，其抑制剂炔丙基甘氨酸（PPG）能减少内源性硫化氢生成，NaHS可增加内源性硫化氢生成。.本项目建立了硫酸铍染毒大鼠、人支气管上皮细胞（16HBE）模型，检测了SOD、GSH-PX、ROS、iNOS、COX的活性及MDA含量，8-OHDG和3-NT，胱硫醚-γ-裂解酶、PI3K、总Akt、p-Akt蛋白及自噬相关蛋白P62、LC3-II、Beclin-1。免疫荧光检测了HO-1、Nrf表达水平。用PPG、NaHS干预、转染CSERNAi等改变大鼠及16HBE细胞内硫化氢生成，探讨了内源性硫化氢对硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤的影响及PI3K/AKT/Nrf-2/HO-1通路在硫酸铍致肺细胞炎症、氧化损伤中的作用。.主要结果如下：.1、BeSO4可致大鼠肺组织及16HBE细胞炎性反应和氧化损伤，引起肺间质纤维化甚至坏死、细胞核固缩等改变，内源性硫化氢可减轻这种损伤。.2、BeSO4可致大鼠肺组织及16HBE细胞中ROS和MDA含量及8-OHDG含量升高，细胞中H2S含量、SOD、GPx和HO-1酶活性降低，CSE、SOD、GPx mRNA及CSE、PI3K、p-Akt、Bcl-2、mTOR蛋白表达下调，上调p53及Bax蛋白表达，差异均有统计学意义(P<0.05)；.3、NaHS能上调16HBE细胞中CSE、PI3K、p-Akt及mTOR蛋白表达（P<0.05），增加Nrf2向胞核内转移，增加HO-1的表达，可减轻BeSO4致16HBE细胞损伤；PPG则下调16HBE细胞中这些蛋白表达加重16HBE细胞损伤。.4、BeSO4可致16HBE细胞自噬体数量增加，P62蛋白表达降低，LC3-II、Beclin-1表达增加。.结论：.1、BeSO4可致SD大鼠肺组织及16HBE细胞炎症反应、氧化损伤及凋亡。.2、BeSO4可减少16HBE细胞内硫化氢含量引起过度自噬。内源性硫化氢通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制B硫酸铍诱导的细胞自噬、减轻细胞损伤。.3、内源性硫化氢对硫酸铍致大鼠肺组织及16HBE细胞炎症反应、氧化损伤有保护作用且是通过激活PI3K/Akt及Nrf2/HO-1信号通路实现。