基于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的甲鱼蛋白肽抗氧化作用机制研究

Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway is the most important antioxidant signal path. Currently, in order to develop antioxidants for the target Keap1/Nrf2 becomes the academic focus, Foodborne antioxidant peptide is a class of important safe biological activity antioxidants, but the antioxidant activity evaluation and action mechanism in cellular level is still very rare. It is also unclear of the mechanisms of the peptides in Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway. This research intends to use turtle peptides as raw material, study on the binding mode and QSAR models with Keap1 protein, to elucidate its action mechanisms. Firstly, through a multi-step modern purification technologies, separation and identification of turtle proteins antioxidant peptides. Then, based on ARE reporter gene, combined with small interfering RNA silencing Keap1 and Nrf2 expression, screening turtle protein source Keap1-Nrf2-ARE inducing peptides. Finally, using the molecular modeling techniques to study the molecular interaction models of Keap1-Nrf2-ARE Keap1 inducing peptide and Keap1 protein, found that the interaction site area, and by the dynamics simulation analysis on molecular targets and bioactive peptide receptor, aims to getting the antioxidant dynamic mechanisms of turtle protein peptide, and by building a receptor protein pharmacophore model to illustrate the donor-acceptor QSAR. The project can provide a reference for the study of other antioxidants activity and action mechanisms.

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是机体内最重要的抗氧化信号通路。目前，以Keap1/Nrf2为目标靶点开发抗氧化物成为学术热点，食源性抗氧化肽是安全性高的一类重要抗氧化物，但从细胞水平评价其抗氧化活性的报道尚少见，其Keap1-Nrf2-ARE信号通路作用机制也不清楚。本研究拟以甲鱼抗氧化肽为对象，研究其与Keap1蛋白的结合模式，构建基于Keap1靶向构效关系模型，以阐明其作用机制。首先，通过多步现代纯化技术、分离和鉴定细胞抗氧化肽；然后，基于ARE报告基因，结合小RNA干扰技术，筛选出Keap1-Nrf2-ARE诱导肽；最后，采用分子模拟技术，研究抗氧化肽与Keap1蛋白的分子互作模式、发现结合区域，通过受体靶点与活性肽的分子动力学模拟分析，得出其动态作用机制，并通过构建基于受体蛋白药效团模型来阐释给体-受体的构效关系。本项目可为其它抗氧化活性物的发现及作用机制的研究提供借鉴。

本研究对甲鱼蛋白源抗氧化肽的功能特性及作用机理开展了深入研究。甲鱼蛋白组分的含量特点为：碱溶蛋白＞水溶蛋白＞盐溶蛋白＞醇溶蛋白。通过微波辅助酶解制备技术，优化了甲鱼抗氧化肽的制备条件，微波耦合酶制备高抗氧化活性甲鱼肽的最佳工艺条件为微波功率300 W、微波时间4 min、酶添加量5%、底物浓度8%，此时酶解产物的DPPH•清除率最高。研究表明，经微波处理后甲鱼肽的红外吸收光谱在1653cm-1处的C=O伸缩峰，及651cm-1处的−(CH2)n−面外摇摆峰均发生偏移，且峰形更为尖锐，显示微波处理后甲鱼小分子肽的二级结构发生改变，有利于提高活性肽的抗氧化活性。研究以DPPH清除率为评价指标，评价35个甲鱼蛋白源肽的抗氧化活性，结果表明，35个甲鱼蛋白源肽中有6个具有抗氧化活性，氨基酸序列分别为GKIYEQCELA，NCA，EDYGA，CTA，CGIECSELLKA，WTKYCKGKDV，其DPPH清除率的IC50值分别为279.50，168.90，1380.61，452.57，393.50，445.02 μg/mL。通过荧光素酶报告基因检测，研究甲鱼蛋白源抗氧化肽对ARE报告基因表达的影响。结果表明，GKIYEQCELA，NCA，EDYGA，CTA，CGIECSELLKA，WTKYCKGKDV 6种甲鱼蛋白源抗氧化肽均能诱导ARE报告基因的表达，并具有剂量依赖性。通过ARE诱导抗氧化肽激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路的分子机制研究，发现，GKIYEQCELA，NCA，EDYGA，CTA，CGIECSELLKA，WTKYCKGKDV能够激活Nrf2/ARE信号通路，表现在诱导ARE报告基因，增强核内Nrf2蛋白表达，下调Keap1蛋白表达，提示ARE诱导活性的抗氧化肽发挥作用需要 Keap1与Nrf2的参与。并证明了具有ARE诱导活性的抗氧化肽可通过降低Nrf2蛋白质降解速度进而增强其稳定性来上调Nrf2的蛋白质水平。通过甲鱼蛋白源Keap1-Nrf2-ARE诱导肽与Keap1蛋白的分子互作模式研究，发现甲鱼蛋白源抗氧化肽与Keap1的Kelch结构域2FLU蛋白的活性中心的氨基酸残基均具有明显的作用力或骨架支撑作用，证实了体外活性较好的原因，NCA和CTA抗氧化活性与BHT接近，并存在明显的与受体作用力，说明稳定性较好，可以作为潜在的高活性肽。