血浆miRNA甲基化与肿瘤相关性研究

miRNA is considered as a key regulator in eukaryotic gene regulation. The methylation of miRNAs has been confirmed in plants and fruit fly, and it has been confirmed that it is related with the stablity of miRNA and organism development. However, it has not been reported that there is methylation in mammal miRNAs. Our previous work show that miRNAs in lung cancer tissues have several modifications, of which m6A and 3' end methylation are dominant. What's more, our miRNA array results show that the level of 3' end methylation of miR-21 is significantly increased in lung cancer tissues and serum. Therefore, we considered that miRNA methylation plays a very important role in the process of tumor biogenesis. What's more, we has developed a novel method for detection of the 2'-O-methylation ratio of certain miRNA in a certain sample. Which will provide a very convenient technology platform for the study of miRNA 2'-O-methylation in plasma.

miRNA被认为是一类重要的调控分子参与了生物体多种生理病理过程。目前在植物及果蝇等模式生物中，已经证实了miRNA的甲基化修饰，并且其与miRNA稳定性及生物体发育息息相关。然而尚未有报导证实哺乳动物的miRNA存在甲基化修饰。本课题组前期工作通过质谱发现在肿瘤发生发展过程中miRNA存在多种修饰，其中以m6A和3’末端甲基化为主。并且，miRNA芯片结果显示，miR-21的3’末端氧甲基化在肺癌组织及血清中有明显升高的趋势。因此我们认为，在肿瘤发生发展过程中，miRNA甲基化可能是个非常重要的过程。并且，我们开发出一套能够精确定量某一样品中miRNA2'-O甲基化的检测方法。这对于研究肿瘤组织与血浆中miRNA的2'-O甲基化提供了一个非常便利的技术平台。

miRNA 的 2’‐O‐甲基化最早由陈雪梅课题组在植物中发现，后续研究表明，许多其他的小分子RNA，如 rRNA 也存在 2’‐O‐甲基化的现象。而哺乳动物来源的 miRNA 2’‐O‐甲基化目前尚未发现有报导。我们课题组通过前期测序发现，肺癌组织及血清中一些 miRNA 可能存在2’‐O‐甲基化。基于此，我们试图弄清miRNA的2’-O-甲基化与肿瘤的关系，以便对肿瘤的发生机制做进一步阐述。 .首先我们采用经典的高碘酸钠氧化法对肺癌及结肠癌患者的血清提取的总RNA分别进行氧化，然后比较氧化前后某些代表性miRNA的含量差异。我们发现，高碘酸钠氧化后运用RT-qPCR法检测到的miRNA含量均有降低，并且对人工合成的miRNA样品也有同样的现象。说明高碘酸钠氧化法结合RT-qPCR法进行miRNA甲基化的检测效果并不理想。于是我们希望找到更好的检测动物来源miRNA2’-O-甲基化的方法。.在poly(A)聚合酶进行加尾反应的过程中，我们发现小RNA的3'末端的2’-O-甲基化修饰能够对该反应起到强烈的抑制作用，并且，不同甲基化比例的小RNA分子与其PCR扩增循环数之间存在非线性相关关系。基于此，我们开发了一种应用poly(A)酶的RT-qPCR技术进行小RNA 3'末端2’-O-甲基化的定量检测方法，通过该方法可以定量检测小RNA分子（包括miRNA,piRNA等）的3’末端2'-O-甲基化水平，并且应用此方法成功定量了拟南芥中MIR168、小鼠肺组织中miR-16及人精浆中的piR-31068的甲基化含量。另外，我们对果蝇的S2细胞系中的甲基转移酶DmHen-1进行了siRNA表达沉默，利用我们的方法检测miR-263a的甲基化含量，发现下调DmHen-1表达后miR-263a的含量有所降低。.遗憾的是，此种方法对于血清或血浆中RNA含量较少的样本的检测尚需优化，只能用于检测生物组织等RNA含量较高的样本。对于肿瘤组织中miRNA的甲基化水平，依据此种方法，我们尚未发现肿瘤与miRNA2’-O-甲基化的相关性。