猪繁殖与呼吸综合征病毒5′非翻译区顺式作用元件的解析

Like other single-stranded positive-sense viruses, the cis-acting elements in PRRSV 5′UTR are very important for viral infectivity and RNA synthesis. But recently, the function and regulatory mechanism in viral replication and transctiption is largely unknown. Based on reverse genetic system platform and the previous research results, 5′proximal SL1 and SL2 are necessary for viral infectivity and replication. The prominent TRS hairpin structure is an important cis-acting element for viral RNA synthesis regulation according to the two different genotypic UTR substitution research. The compensatory mutant sites residing in RdRp are also found. In this study, based on the previous research result, combining Mfold prediction and structure probing to define the secondary structure of PRRSV 5′UTR, in order to construct a series of 5′UTR mutant clones and study the effect of mutation on viral life cycle and then to identify the cis-acting elements in replication and transcription regulation. In order to study the genetic interaction between cis-acting elements and RdRp, combining with the reverse genetic manipulation, we use EMSA to test the RNA binding activity of parental RdRp and the mutant 5′UTR in vitro transcripts, and use the in vitro polymerase activity assay to test the RNA synthesis activity of mutant RdRp with compensatory mutant sites. The research will be very important for dissection of the cis-acting elements and the regulatory mechanism and could provide the theoretic foundation for insight of viral replication and transcription processes and also PRRSV prevention and control.

与其他单股正链RNA病毒一样，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）5′非翻译区（UTR）中的顺式作用元件对病毒的感染性和RNA合成是至关重要的。但是目前对其结构与功能机制还知之甚少！在前期研究中发现病毒5′末端茎环结构SL1和SL2对病毒的感染性是必需的；初步确定TRS所在的最大的发夹结构是调控病毒RNA合成过程的重要顺式作用元件；并发现突变病毒的RdRp编码区因5′UTR的突变产生了补偿性的氨基酸突变位点。本研究拟在此基础上，结合预测和酶法化学法确定5′UTR的二级结构，并以此建立系列突变体克隆，研究这些突变对病毒的影响，从而鉴定出调控复制和转录的顺式作用元件。通过亲本RdRp与5′UTR突变体外转录本的EMSA、突变RdRp的体外聚合酶活性试验，结合反向遗传操作研究顺式作用元件与RdRp的相互作用。本研究为深入了解病毒复制转录过程及PRRSV防控奠定理论基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原，此病以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为特征，是世界养猪业的一个巨大的威胁。PRRSV可以分为欧洲型（1型）北美型（2型）。关于PRRSV基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的转录和蛋白翻译、病毒颗粒组装以及病毒致病机理等许多问题仍待解决。目前，大量研究已经证明，PRRSV基因组的5′ 非编码区（5′ UTR）对病毒复制至关重要，本项目基于实验室构建的2型PRRSV全长感染性克隆pAPRRS，构建了一系列5′ UTR 的5′ 端缺失、插入、突变、两型替换的克隆，通过病毒拯救、病毒学特性分析等初步解析了PRRSV的5′ UTR中的一些顺式作用元件的结构与功能，对进一步剖析病毒致病机理有重要意义。研究结果如下：PRRSV的5′ UTR中第一个和第二个茎环结构（Stem Loop， SLS）是病毒感染细胞必不可少的。人为缺失第一茎环的一级序列，病毒会利用一些未知来源的，非模板依赖性的AU-rich外源序列所修复。基于2型PRRSV基因组骨架，1型5′ UTR在功能上可以完全替代2型的5′ UTR。两型5′ UTR相互替换的突变病毒与亲本病毒相比nsp9区域发生了碱基突变，此区域为病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）编码区，将这些突变人为单个引入或者随机组合引入感染性可隆中，发现拯救的病毒滴度比原突变病毒高，空斑形态也有所变化，加上体外转录的5′ UTR与表达的RdRp的相互作用实验，结果表明病毒5′ UTR发挥作用是与RdRp密切相关的，异源的5′ UTR通过突变的RdRp共同作用完成病毒的拯救过程，发挥调控作用。本项目研究对于了解PRRSV的生命活动过程有重要意义。