猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP9功能研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome seriously damages the breeding industry of our country even the world,is rather important infectious disease.In 2006,the first outbreak of the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome disease resulted in seriously economic loss to our country field of breeding,and concerns from its pathogenicity obviously enhancing had rised.This study utilizes technology of established reversed genetic operation platform based on the research of the past,researching porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 9 functions in process of virus replication and transcription, and entirely reveals the molecular mechanism of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infectivity and pathogenicity,finally supplied valuable exprimental data. Furthermore, also develops effective vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus,and takes control of porcine reproductive and respiratory syndrome,reduces loss in stock farming.

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是目前严重危害我国乃至世界养猪业最重要的传染病，而2006年在我国首次爆发的高致病性蓝耳病给我国养猪业造成了重要的经济损失，其致病能力显著增强的现象引起人们高度关注。本研究拟在过去的研究工作基础上，制备nsp9单克隆抗体，研究nsp9在病毒感染中的表达量变化；同时利用本课题组已建立的稳定反向遗传操作平台技术，研究PRRSV nsp9在病毒复制与转录过程中的作用，分析变异PRRSV与经典PRRSV毒株NSP9功能的差异，为揭示蓝耳病病毒感染和致病的分子机理提供理论依据，该研究结果还可以为研制猪繁殖与呼吸综合征病毒的高效疫苗奠定基础，进而控制猪繁殖与呼吸综合征，减少对畜牧业的危害。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）首先在北美洲和欧洲发现，我国于1995年首次分离到PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）。2006年以来我国以JXA1为代表的高致病性蓝耳病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。.本项目中我们首先从广东省各个地区的病料中，通过RT-PCR等技术，总共等到25条Nsp9的序列，通过分析表明与JXA1株处于同一个分支上，说明了高致病型PRRSV在广东地区广泛流行。为了研究Nsp9基因对于病毒生物学活性的影响，我们制备了针对Nsp9的多克隆抗体和单克隆抗体，发现Nsp9蛋白主要存在细胞质中，且在病毒感染的36小时后，Nsp9基因的数量达到最大。同时我们构建出缺失Nsp9基因的全长质粒，发现不能进行拯救出病毒，说明Nsp9蛋白对于病毒的拯救很重要。而后我们利用siRNA的设计原则，针对PRRSV Nsp9基因的保守区，构建了四组干扰质粒。通过间接免疫荧光，RT-PCR等验证了干扰质粒对PRRSV复制的抑制作用。由于临床上高致病PRRSV和经典型PRRSV对于猪的致病性有很大的差别。为了研究不同致病性病毒的Nsp9基因对于病毒生物学活性的影响。我们将CH-1R的Nsp9序列替换到XH-GD的感染性克隆上，成功拯救病毒。之后我们对拯救病毒的生物学特性进行探索。我们发现拯救病毒的生长速度和滴度高于亲本毒株，低于CH-1R，我们推测CH-1R的聚合酶有助于提高病毒的滴度。.综上所述，我们发现广东地区流行的毒株的Nsp9基因与以JXA1为代表的高致病蓝耳病相似；通过真核表达，间接免疫荧光等技术，我们证明了Nsp9蛋白在感染后的36小时表达量最高，且Nsp9蛋白主要表达在细胞质中。通过反向遗传技术，我们证明Nsp9对于病毒的拯救是必需的，同时我们针对Nsp9基因设计的siRNA能很好的抑制病毒复制。将强弱毒的Nsp9基因进行替换，替换了CH-1R Nsp9序列的XH-GD嵌合病毒表现出更快的生长速度和更高的滴度。说明CH-1R的Nsp9的酶活性要高于XH-GD Nsp9的酶活性。同时我们制备了针对Nsp9蛋白的多克隆和单克隆抗体，为下一步的研究打下来坚实的基础。