基于载体构-效关系设计的多功能高效肺靶向siRNA传递系统研究

为了研究一种新型的高效无毒的siRNA肺靶向传递系统，本科题以DNA重组技术为基础，构建一条重组的DNA序列(Cys-EGF-（KHKHKHKHKK）6 -TAT- (6His) -Cys)。该重组序列经表达后所获得的重组蛋白质将成为拥有包载核酸能力（正电荷的赖氨酸残基）、靶向特异性细胞能力（表皮生长因子序列）、穿越细胞膜障碍进入细胞浆能力（TAT）的多功能基因载体。并且，在该蛋白C端引入的寡聚组氨酸序列可用于高效纯化，两端加入半胱氨酸，使载体能在体外经过条件温和的一步反应，通过二硫键与PEG结合，从而在全身用药中取得良好效果。以siRNA(抑制Bcl-2基因)为模型基因，系统研究该载体的构建、生产、纯化、性质、体内外基因转染效率、肿瘤抑制效率等。为新型siRNA传递系统的构建和癌症的siRNA治疗研究提供科学依据。

本课题以构建一种高效安全的肺靶向siRNA传递系统为目标。我们首先尝试以DNA重组技术为基础，构建一条基因表达序列：mVEGF-KH-TAT。其中，mVEGF为小鼠血管内皮生长因子基因片段，TAT为穿膜肽片段。测序表明，成功得到了含有该序列的表达质粒。将上述得到的质粒转化入相应的工程菌进行原核表达。我们考察了目的重组序列在不同载体以及不同原核表达系统中的诱导情况；同时我们也对各种表达条件进行了优化。但由于表达的目的蛋白中含有大量碱性氨基酸，对原核表达宿主菌有很大毒性，未能检测到目的蛋白的表达。在后续工作中，我们选取牛血清白蛋白（BSA）为载体，再将阳离子材料通过化学手段连在蛋白上，使其具有携载siRNA的能力。通过缩合剂EDCI，可将乙二胺上的氨基与BSA表面的羧基缩合，生成酰胺键，成为阳离子化的BSA，命名为CBSA。经过SDS-PAGE和阳离子交换层析等方法验证了产物合成成功。接下来我们考察了CBSA/siRNA复合物的形成。结果表明，CBSA能很好的与siRNA形成稳定的纳米粒，粒径在150nm~250nm之间，zeta电位为15mV到30mV之间，透射电镜观察到形成的纳米粒是较为规整的球形颗粒。CBSA对siRNA的包封率达到94.89% ± 0.27%。同时，与该复合物能很好地保护siRNA抵御RNA酶或小鼠血清的降解作用。另一方面，CBSA能够明显提高siRNA进入细胞的能力，且CBSA/siRNA主要通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。通过MTT考察了CBSA/siRNA的毒性，在较大的浓度范围内（小于2μg/mL），CBSA没有表现出明显的毒性。最后我们考察了CBSA/siRNA体内分布的情况，相比游离核酸和商品化阳离子脂质体（Lipofectamine2000）组，CBSA可以明显提高siRNA在肺部的分布，显示出良好的肺靶向性。. 综上所述，本研究利用化学方法连接蛋白与阳离子材料，构建了新型的基因载体，实现了肺部靶向基因传递的目的。在该基金项目的资助下，我们共发表SCI论文7篇，影响因子均在3以上，最高影响因子7.4；在国际会议2上进行分会报告2次，培养研究生3名。项目负责人，2012年荣获“中国药学会-石药青年药剂奖”；2011年荣获第十一届四川省青年科技奖；作为第3完成人，2011年荣获四川省科技进步一等奖。