上游开放阅读框对拟南芥G蛋白α亚基的蛋白翻译调控作用及其机理研究

Guanine nucleotide-binding protein (G Protein) is a key regulator of biotic and abiotic stress response in plant, the expression of which is under the fine-tune control of the complex signaling network. Bioinformatic analysis showed that upstream open reading frames (uORFs), previously reported to regulate protein translation in mammalian and yeast, are widely distributed among plant genomes. However, the roles and the underlying molecular and biochemical mechanisms of the uORFs in translational control in plants remain largely unclear. Our previous study revealed that the mRNA of G protein α-subunit 1 (GPA1) contains four potential uORFs, implying that there lies uORFs-mediated translational control in plant G protein signaling. Thus, we plan to construct 35S::GPA15’UTR-GUS reporter line to identify the roles of uORFs in regulating GPA1 translation; explore the effects of ILA (ilityhia)-GCN2 (general control non-derepressible 2) complex on phosphorylation of eIF2α and translational control of GPA1 by GUS reporter line and western blot; and reveal the roles and mechanisms of ILA-GCN2 in pathogen-induced stomatal closure by genetic analysis, to elucidate a novel uORFs-mediated regulating mechanism of G protein α-subunit. Our research will extend our knowledge on the regulatory network and mechanism of stomatal closure induced by pathogen and other stresses.

G蛋白是重要的植物逆境胁迫调控因子，受到植物体内复杂的信号调控网络的精确调控。我们在前期对拟南芥中的uORFs进行预测分析发现编码G蛋白α亚基的GPA1含有4个可能具有功能的uORFs，推测拟南芥中可能存在uORFs介导的对G蛋白翻译水平的调控机制。本项目拟利用GUS报告系统明确GPA1的uORFs对蛋白翻译的调控作用；利用蛋白质印迹解析ILA-GCN2复合体对eIF2α的磷酸化和GPA1蛋白翻译的影响；利用突变体分析ILA-GCN2复合体与GPA1在调控病原菌诱导的气孔开闭中的功能及其作用机理，阐明基于uORFs的Gα亚基的表达调控新机制。这一研究结果对植物病原菌及其它胁迫条件下气孔关闭的调控网络和机制研究将产生重要影响。

G蛋白α亚基是G蛋白信号的重要调控节点，在植物生长发育和胁迫应答等过程中起到关键作用。之前，对于Gα亚基转录水平调控已研究的较为清楚，但翻译水平的调控及其机制并不明晰。本研究发现拟南芥Gα亚基GPA1上存在四个上游开放阅读框（uORFs），通过生理生化、遗传等研究手段揭示uORFs在调控其蛋白翻译以及生物学功能中起到关键作用，从而建立了一条新的翻译水平的G蛋白信号的调控途径。所取得的主要结果如下：.（1）拟南芥G蛋白α亚基上存在四个调控其蛋白翻译的uORFs.对拟南芥GPA1基因全长mRNA进行序列分析发现其5’UTR区域存在四个uORFs，其中uORF1可以编码49个氨基酸的多肽。构建35S::GUS和35S::GPA15’UTR-GUS报告载体，瞬时转化烟草叶片后利用GUS组织化学染色、GUS酶活性定量和融合6×His-tag特异的抗体蛋白印迹分析发现GPA1的5’UTR区域影响GUS基因的蛋白翻译。分别将四个uORFs的起始密码子突变后分析发现主要是uORF1在调控蛋白翻译过程中起作用。这些结果证实拟南芥G蛋白亚基上存在四个uORFs对其蛋白翻译起到重要调控作用。.（2）ILA与GCN2互作调节GPA1的蛋白翻译进而影响气孔开闭.酵母双杂交和双分子荧光互补实验揭示ILA与GCN2之间存在蛋白互作，且互作区域位于ILA的C端与GCN2的N端之间。通过构建突变体材料研究发现ILA与GCN2均影响eIF2α的磷酸化及GPA1蛋白的翻译水平，且ILA突变后35S::GPA15’UTR-GUS的GUS表达受到抑制。病原菌DC3118处理能诱导野生型拟南芥气孔关闭，而在突变体ila-3、gcn2和gpa1-3中气孔均不能正常关闭，但是如果在ila-3和gcn2中过量表达GPA1后气孔又能够正常关闭，这些结果表明在调控病原菌诱导的气孔关闭过程中GPA1位于ILA和GCN2的下游。.基因表达受到转录和翻译两个水平的调控，但是后者往往被忽视。通过本项目研究，揭示了一条G蛋白α亚基表达调控的新途径，即uORFs介导的翻译调控，对Gα亚基乃至整个G蛋白信号调控网络和机制研究将产生重要影响，也为病原菌乃至其他胁迫诱导气孔关闭的分子机制研究提供新的思路。