从巨噬细胞胞葬及表型转化规律研究回阳生肌法促进慢性皮肤溃疡（阴证）愈合的机制

Chronic skin wound with Yin syndrome mostly developed into non-healing wound, of which pathological characteristic is an extensive inflammation phase. Recent studies have shown that wound macrophage dysfunction such as efferocytosis and phenotype transition is one of important reason of healing failure caused by persist inflammation. 'Rescuing Yang and improving tissue regeneration' is the basic principle, which showed positive effect in improving chronic wound healing by typical prescription of 'Hui Yang Sheng Ji' ointment. The former results showed that 'Hui Yang Sheng Ji' ointment promoted impaired wound healing by modulating macrophage phenotypic transition and ameliorating wound microenvironment. This program propose to explore the possible effect of 'Hui Yang Sheng Ji' ointment on tissue apoptosis, macrophage efferocytosis and phenotype in chronic skin wound from clinical observation. Meanwhile，further to explore the effect of two sub-principles 'Reinforcing Qi and Warming Yang' and 'Activating Blood and Dredging Meridian' on macrophage efferocytosis, phenotype transition, cytokines and signal transduction pathways, two delayed healed-wound models and in vitro macrophage are used for integrative study of 'syndrome, principle and efficiency' to enrich TCM theory of 'rescuing Yang and improving tissue regeneration'.

慢性皮肤溃疡（阴证）是慢性难愈性皮肤溃疡常见证型，表现为炎症的迁延性时相过程。研究表明，巨噬细胞功能下降尤其胞葬功能及表型转化障碍是导致慢性皮肤溃疡炎症持续存在及创面难以愈合的重要原因。回阳生肌法是治疗阴疮的基本冶则，回阳生肌膏是其代表方剂，临床疗效肯定。前期研究结果证实回阳生肌膏可促进巨噬细胞表型转化，改善创面微环境、促进创面愈合。因此，本项目从临床、动物、体外实验三个层面进行研究。首先观察回阳生肌膏对慢性皮肤溃疡（阴证）患者疮周组织细胞凋亡、巨噬细胞胞葬功能及表型转化的影响，阐明回阳生肌法干预作用和机制。同时，通过两个小鼠伤口愈合迟缓模型及体外巨噬细胞模型，探索回阳生肌膏体现的益气温阳、活血通络治则对巨噬细胞胞葬功能、表型转化、细胞因子分泌及信号通路的调节作用，分析回阳生肌法则的证-方-效相应，从而阐明 "阴证"疮疡的实质，提升回阳生肌法的科学内涵，为临床用药提供理论指导。

巨噬细胞功能下降尤其胞葬功能及表型转化障碍是导致慢性皮肤溃疡炎症持续存在及创面难以愈合的重要原因。本课题通过回阳生肌法的代表方剂回阳生肌膏对慢性皮肤溃疡（阴证）患者创面、免疫抑制小鼠和II型糖尿病db/db小鼠愈合迟缓皮肤伤口及体外巨噬细胞进行研究。结果显示回阳生肌膏可提高模型小鼠慢性创面的愈合率，减轻创面炎症反应；促进成熟胶原生成从而形成新生肉芽组织；促使创面局部巨噬细胞数量增多，其中M1巨噬细胞数量减少、M2型巨噬细胞数量增多；同时降低创面局部M1型细胞因子的基因和蛋白表达，上调M2型细胞因子表达。体外实验采用未分化巨噬细胞和诱导的M1型巨噬细胞模型，发现回阳生肌膏的醇提物可降低M1型细胞因子表达，上调M2型细胞因子表达；下调iNOSmRNA和上调Arg-1mRNA水平。此外回阳生肌膏提取物升高巨噬细胞胞葬通路相关蛋白G2AmRNA、Tim-4mRNA、 Cdc42蛋白 和Rac1活性，从而增强其胞葬功能。通过以上研究证实回阳生肌膏可通过增强巨噬细胞的胞葬功能、促进表型转化（M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞），促使创面由炎症期进入增生期，是其促进慢性创面愈合的主要作用机制。.进一步研究发现以回阳生肌膏治则拆方益气温阳方和活血通络方对两种动物模型均具有促愈合作用，也调控巨噬细胞表型转化和胞葬功能。活血通络方对免疫抑制小鼠创面愈合作用更为明显；益气温阳方对糖尿病db/db小鼠创面愈合作用更为明显。益气温阳方调控M1型巨噬细胞功能优于活血通络方，而活血通络方对M2巨噬细胞作用优于益气温阳方。表明益气温阳方和活血通络方对不同创面的愈合作用靶点不同。.本研究从体内外研究，以巨噬细胞的功能异常为靶点阐释了回阳生肌膏的证-方-效相应，从而阐明 “阴证”疮疡的实质，为提升回阳生肌法的科学内涵和临床治疗提供了理论指导。