Tbx3和HCN4基因共修饰骨髓间充质干细胞重建窦房结功能的研究

电子起搏器植入治疗的局限性敦促人们在缓慢性心律失常的治疗中不断寻找新希望。将体外分化的具有起搏功能的心肌样细胞植入病变心脏达到生物起搏是未来起搏器的发展方向。重建窦房结的尝试，目前主要以HCN4基因转染骨髓间充质干细胞（MSCs）后植入心脏，其虽能分化成心肌样细胞，但由于缺乏窦房结标记基因，功能上与窦房结细胞仍有差距。T-box基因家族属发育调控相关转录因子，其家族成员之一Tbx3在胚胎发育成熟晚期存在于窦房结前体细胞中使之保留起搏功能并抑制窦房结前体细胞向心房肌细胞分化。本课题拟将Tbx3和起搏基因HCN4共转染犬MSCs后一并植入窦房结功能障碍的犬右心房，通过Tbx3对窦房结细胞表型和功能上的重要作用，重点研究其对窦房结起搏功能重建及其对自主神经调节的反应、心房心肌细胞向窦房结细胞的转化、起搏电流If改变的影响，希望获得起博性能稳定耐久的新型生物起博器，进而为将来临床应用奠定基础。

本实验成功扩增出基因片段attB1- NdeI-ScaI-HCN4(后端)-T2A-TBX3(前端)-EcoRI-attB2，attB1- NdeI-hHCN4（后端）/T2A/eGFP –attB2，attB1-Kozak-TBX3(前端)-EcoRI-attB2，EcoRI-TBX3(后端)-P2A-eGFP- EcoRI 2。2、BP反应得到入门载体pDown-NdeI-ScaI-HCN4(后端)-T2A-TBX3(前端)-EcoRI后用NdeI/EcoRI双酶切进行鉴定，菌落鉴定 pDown-hHCN4(后端)/T2A/eGFP和pDown-TBX3(前端)-EcoRI。3、NdeI/ScaI双酶切和T4连接反应得到入门克隆pDown-hHCN4(全长)/ T2A/TBX3(前端)-EcoRI和pDown-hHCN4(全长)/T2A/eGFP，NdeI/ScaI双酶切鉴定。4、EcoRI酶切和T4连接反应得到入门克隆pDown-hHCN4(全长)/ T2A/TBX3(全长)和pDown-TBX3(全长)/ P2A/eGFP，EcoRI酶切鉴。5、LP反应得到pLV.EX2d.null-CMV>hHCN4/T2A/TBX3/P2A/eGFP，pLV. EX2d.null-CMV>TBX3/P2A/eGFP，pLV.Des2d.null-CMV>hHCN4/T2A/eGFP，菌落PCR鉴定。6、四质粒转染293 FT细胞后，荧光显微镜结果表明成功构建hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四种慢病毒颗粒。病毒滴度测定分别为4.7×107TU/ml、5.2×107TU/ml、4.5×107TU/ml、6.7×107TU/ml。7、四种慢病毒转染后的ES细胞挑克隆纯化后荧光表达正常，RT-PCR示目的基因表达良好。8、四种转染小鼠ES细胞，含hHCN4-eGFP及eGFP细胞形态良好，荧光率较高，含hTbx3-eGFP和hHCN4-hTbx3-eGFP细胞状态相对差，荧光虽然明显，但表达不强，培养上清可见漂浮的死细胞。进一步的MTT和流式细胞仪（Annexin V-PE）检测示hTbx3-eGFP、 hHCN4-hTbx3两组细胞生长速度明显减慢，凋亡率显著增高（P<0.05），提示Tbx3过表达对ES细胞无增殖促进作用