葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在紫花苜蓿响应低温耐受性中的作用机理研究

The problem of pasture wintering has become a restrict bottleneck to stockbreeding development in the high altitude and cold region of Qinghai-Tibet Plateau. Owning to the “QingDa 1” obvious cold resistance in Qinghai region, the project plans to take it as the object in this study, take the diversity of the respiratory metabolism as a starting point for innovatively researching its cold adaptation mechanism and confirm the regulating effect of glucose - 6 - phosphate dehydrogenase (G6PDH, which is the key enzyme of pentose-phophate pathway) on alfalfa cold adaptation. The G6PDH gene is cloned to construct the over-expression and interference vectors, the transgenetic seedlings are obtained by genetic transformation, and further study the tolerance mechanism to low temperature combining with signaling molecules. Thus, clear the role of G6PDH in signal transduction pathways in response to low temperature of alfalfa, and uncover the mystery of alfalfa which planted in spring but can’t grow green safely in next spring in theory and practical.

青藏高寒地区牧草越冬问题已成为限制该地区畜牧业发展的瓶颈，本项目拟以在青海地区具有明显抗寒性的“青大1号”紫花苜蓿为研究对象，以呼吸代谢的多样性为出发点进行创新研究其冷适应机制，确定磷酸戊糖途径的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)在苜蓿冷适应中的调节作用。通过克隆G6PDH基因构建其超表达和干扰载体，使用遗传转化法获得其转化植株，进一步结合信号分子研究其对低温的耐受机制，从而明确G6PDH在紫花苜蓿响应低温的信号转导途径中的地位，在理论和实践上研究环湖地区紫花苜蓿种植翌春不能安全返青的谜团。

本项目旨在探究在青海高寒地区具有明显生长优势的“青大1号”紫花苜蓿G6PDH（MsG6PDH）基因在响应低温胁迫方面的作用机制。.以“青大1号”紫花苜蓿为材料，借助RACE技术获得了cDNA全长为2260bp的MsG6PDH基因，其开放阅读框大小为1752bp，编码583个氨基酸；与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆等序列一致性达到88%，与豆科植物绿豆、野毛豆、大豆亲缘关系最近；预测MsG6PDH蛋白二级结构中α-螺旋占37.91%，β-折叠占5.66%，无规则卷曲占40.31%；Mr为65.71kD；pI为8.25；不稳定系数为44.54，为不稳定的亲水性蛋白。.构建了MsG6PDH超表达和基因编辑载体，将其转化拟南芥获得了阳性植株。表型上，超表达体的叶片较野生型圆，叶柄较短，而基因编辑体的叶片性状与野生型差异不显著；CRISPR-MsG6PDH-1根毛明显较野生型和超表达体多而密，而CRISPR-MsG6PDH-2相比野生型和超表达体根毛明显较少。镉胁迫下，MsG6PDH超表达较基因编辑植株和野生型抗性较强；发现H2O2能够诱导MsG6PDH超表达体和野生型积累花青素，而MsG6PDH基因编辑植株不积累花青素；低温胁迫下，MsG6PDH超表达体较野生型和基因编辑体表现出一定的适应性，低温诱导了紫花苜蓿G6PDH活性的增强，其具体机制有待进一步的优化研究。.基于转录组测序，经筛选低温组与对照组、低温组与恢复组差异表达基因分别为751、26和86个。经KEGG分析主要是参与碳水化合物代谢、翻译和降解相关基因。CBF、COR、GRAS、Dof和其他蛋白家族的成员等参与低温胁迫基因有明显的上调或者下调。部分基因在植物响应低温胁迫中具有普遍性，而一些是紫花苜蓿特异性基因。该研究结果有助于了解紫花苜蓿耐受低温的分子机制，为今后的研究和育种提供重要数据支撑。.除此之外，在本项目的资助下克隆了尼泊尔黄菫G6PDH基因，获得了其阳性转化植株，同时验证了其对逆境的响应；比较了尼泊尔黄菫和紫花苜蓿G6PDH基因的差异；基于转录组和代谢组联合分析了尼泊尔黄菫颜色积累相关代谢产物和候选基因分析。所得结果将为后期开展紫花苜蓿和尼泊尔黄菫G6PDH在响应非生物胁迫机理的比较研究提供数据支撑。