FAM40A在局灶性节段性肾小球硬化发病机制中的作用研究

Previously, we harvested a familial Focal Segmental Glomerulosclerosis（FSGS）family of five generations with 54 members, 3 of 12 patients were proved FSGS by renal biopsy. Applying linkage analysis and exome sequencing ,as well as further filtered,its causative gene was finally identified to be FAM40A ,which plays an important role in regulating cytoskeletal dynamics and cell morphology...In addition,our preliminary experiments demonstrated that: FAM40A immunohistochemisty staining was present in glomerular epithelial cells (podocytes and parietal epithelial cells) and collecting duct cells of normal and control rats.Levels seemed to go up in podocytes with disease with a progressive increase over time in PHN(MN model) .An increase was also seem in the PAN (MCD model).No staining was present when the primary antibody was omitted...For studying FAM40A biologic relevance and its potential roles in the pathogenesis of FSGS,our experimental designs are ①In epidemiological,FAM40A gene mutation sites will be screened in familial and sporadic FSGS patients ; ② In vitro,a series of interfered podocyte experiments are going to be implemented to illustrate FAM40A protein location and distribution, as well as the role in modulating podocyte cytoskeletal dynamics and motility of podocyte foot processes; ③In vivo, we will apply of Target Podocytes RNAi technology and FAM40A-modified rat models to reveal the role of FAM40A in the pathogenesis of FSGS,and further to explore the possibility of FAM40A target evaluation of FSGS pathology and genetics therapeutic intervention.

前期我们发现一5代54名成员的家族性FSGS家系，通过连锁分析和全外显子测序及进一步家系内过滤筛查，已明确其致病基因为FAM40A ；预实验证实该基因在大鼠肾足细胞上有表达，遂建立典型足细胞病变的MN和MCD大鼠模型,发现随建模时间的延长其表达明显增加；生物信息学分析：FAM40A可能通过调节足细胞骨架的动态变化，导致并参与了FSGS的发病过程。据此本课题将①对已获得的家族性及散发性FSGS患者进行FAM40A基因突变的筛查；②体外培养足细胞，应用共聚焦显微镜、免疫共沉淀等方法观察FAM40A蛋白的定位、分布及其在调节足细胞骨架的动态变化中的作用；③应用体内足细胞定向siRNA等技术，建立FAM40A M521T突变和沉默模型，在体内研究FAM40A在FSGS发生、发展中的作用。目的在于揭示FAM40A在FSGS发病机制中的作用，探讨以其为靶点对FSGS的病理评价和遗传学治疗干预的可能。

局灶性节段性肾小球硬化症是以局灶节段分布的肾小球硬化及足细胞变性所致足突融合或消失为主要病理特征的肾小球疾病，前期我们对一遗传性局灶节段性肾小球硬化症大家系，通过连锁分析和全外显子测序等方法，确定其致病基因为 FAM40A。本项目主要研究了FAM40A在足细胞细胞骨架调节中的作用以及突变型FAM40A对足细胞细胞骨架和细胞形态的影响及机制；并进一步探究了FAM40A在参与FSGS发病中可能的作用机制。重要结果： 在小鼠足细胞，FAM40A 主要定位均在细胞核内和核周围的胞浆里。分化成熟的足细胞在FAM40A 蛋白被沉默后，F-actin在靠近质膜的区域分布增加，在胞浆的中央区分布明显减少，细胞边缘变得毛糙，细胞形态发生了较大改变。突变型FAM40A 会破坏细胞骨架F-actin在足细胞的正常分布，细胞形态改变，足突结构消失，并减少裂孔隔膜的功能蛋白Nephrin的表达。FAM40A突变可能通过Arp2、CTTNBP2影响骨架蛋白F-actin与nephrin的表达。进一步在足细胞上，通过表达谱基因芯片扫描及高级分析发现：与Fam40a表达最密切的基因为laminin相关亚型lamb1、lamb2等。体外实验证实：肾小鼠足细胞上Fam40a沉默后Laminin表达下降。免疫组化发现：和原发性FSGS患者相比我们发现的FFSGS患者laminin表达量降低。同时，成功构建了Fam40a条件性敲除小鼠模型，发现Fam40a杂合子小鼠第8周出现24小时尿蛋白增多，第9周肾脏病理电镜提示：基底膜增厚、皱缩；足突广泛融合。我们的实验提示FAM40A可能是一种新的足细胞细胞骨架调节因子,FAM40A表达的改变很有可能导致足细胞以及足细胞间裂孔隔膜发生变化，进一步影响到肾小球滤过屏障的功能，从而在临床上导致了蛋白尿的发生。关于 FAM40A 对细胞骨架的调节、维持足细胞以及足细胞间裂孔隔膜完整性及功能的具体机制，需要我们进一步进行更为详尽的探讨，希望可以揭示 FAM40A以及突变型FAM40A更多不为人知的功能作用，为进一步丰富我们对FSGS 的发病机制新的认识。