人Ino80染色质重塑酶在小鼠胚胎干细胞自我更新以及胚胎发育早期中作用的研究

胚胎干细胞(ESCs)是从早期胚胎中分离出来的全能干细胞，具有在体外无限自我更新的能力和可分化为各种组织细胞潜能的特性。研究表明，上述特性与以下两点有关：1）通过Oct4,Sox2和Nanog这三种与ES细胞多能性相关的转录因子,来抑制能使其分化的关键转录因子的转录，同时还能激活与其维持自我更新相关基因的转录；2）一些染色质重塑酶通过改变染色质的结构来改变ESCs中一些相关基因的表达。在本课题中，我们将用小鼠的ESCs作为实验模型，通过构建可诱导表达人Ino80蛋白质的小鼠ESCs、结合用siRNA Knockdown基因的方法，并利用多维蛋白质质谱、DNA芯片以及ChIP-Seq等技术，来研究哺乳类Ino80染色质重塑酶在小鼠ES细胞自我更新以及胚胎早期发育时的功能，为今后弄清Ino80染色质重塑酶与人类疾病发病之间的关系，并应用于替代医学打下坚实的理论基础。

Ino80染色质重塑酶（Ino80）是SNF2 ATP酶家族成员之一，是一个由15个蛋白亚基组成的酶复合物。研究表明，Ino80对细胞和生物体的基因转录、DNA复制及损伤修复等过程起着极其重要的作用。在本项目中，为了更好的阐明Ino80在mESC的自我更新和早期分化阶段中的作用，我们首先在HeLa以及293T细胞中利用siRNA/shRNA敲低了Ino80复合物中关键亚基的表达，并通过DNA芯片和RNA-Seq技术获得了Ino80复合物的基因表达谱。根据统计学分析并结合生化实验我们从众多的候选靶基因中确定了与细胞周期密切相关的p21是Ino80重塑酶的靶基因。免疫印迹/细胞染色/ChIP/siRNA或shRNA敲低等系列实验结果阐明Ino80通过负调控p21基因参与细胞周期的正常运行以及染色质稳定性的维护，此部分研究内容发表在Plos One杂志上（Cao et al., 2015, 10: e0137411）。另外，我们研究发现与p21 和肿瘤抑制因子BRCA2密切相关的BCCIP基因也受Ino80的调控，提示Ino80可能参与肿瘤的发病机理，此部分研究内容发表在Oncol Lett（Su J, et al., 2015）。已知在酵母中Swr1染色质重塑酶可以调控组蛋白变体H2AZ在基因组上的分布，同时，H2AZ又可以抑制p53依赖的p21转录，提示p21的基因转录与H2AZ在基因组上的时空分布密切相关。鉴于p21基因转录同时被H2AZ和Ino80所调控，我们推测对p21基因的转录调控至少可能与Ino80-H2AZ的相互协调作用相关。为此，我们把Ino80在小鼠胚胎干细胞（mESC）中是如何通过调控组蛋白变体H2AZ在基因组上的分布来参与其相应靶基因的转录(如p21)，从而维持其多能干性和促进其早期分化作为研究重点。我们利用siRNA干扰以及ChIP技术，并结合ChIP-seq分析力求寻找Ino80的靶基因。统计分析发现在mESC中，Ino80不仅参与调控多能性相关基因的表达，同时也参与调控与分化相关基因的表达。目前，我们正在对ChIP-seq数据进行进一步分析，以便阐明Ino80-H2AZ在基因组上的分布以及其协同作用在胚胎干细胞的多能性维持及分化过程中作用，为今后针对胚胎干细胞的各项基础研究及其在再生医学中的应用研究提供坚实的理论依据。