人Ino80染色质重塑酶的结构及其转录功能的研究

Ino80重塑酶是SNF2 ATP酶家族成员之一，是一个由多分子亚基所组成的依赖ATP能量的复合物。在ATP能量驱动下Ino80可以导致核小体的置换或重新排列。有研究表明，它的功能与体内的转录，DNA修复以及复制等过程有关。与酵母相比较，人的Ino80复合物除了包含有形成酶活性核心的共同亚基外，还包含一些人所特有的亚基。本课题将以从人的稳定表达细胞株中纯化和在昆虫细胞中进行重组的方法，利用生化学方法来阐明人Ino80复合物的结构以及其中各个亚基之间的相互关系，再结合DNA芯片技术来检测人类Ino80复合物的靶基因及相关的信息传递途径，进而为以后研究其与肿瘤发生的关系，并为相关肿瘤的分子靶向治疗药物的开发，提供坚实的理论依据。

我们通过构建不同hIno80欠失体的293稳定细胞株，经亲和纯化并进行蛋白质谱检测，证明hIno80复合物在Ino80p上形成了由HSA和Insertion两个功能域组成的酶活性中心，并与其DNA滑动活性有关。另外，hIno80p的C端对ATP水解酶活性有抑制作用，而hIno80p的N端则形成了由哺乳类特异亚基所组成的调节功能域。我们还在昆虫细胞用杆状病毒共感染和免疫沉淀方法，验证了HSA和Insertion功能域中各亚基间的作用关系。这部分研究是与美国Stowers医学研究所Conaway教授合作进行，相关数据已于2011年共同署名发表在JBC上。另外，我们在HeLa细胞中用siRNA敲低hIno80复合物中保守亚基Ino80p、Arp5、Arp8、Ies2和Ies6，并结合DNA芯片技术，检测了其相应的基因表达谱。结果显示，hIno80重塑酶主要与细胞周期、细胞凋亡以及肿瘤发生相关基因的调控有关。进而，做了如下的深入研究，（1），在293细胞中瞬转过表达hIno80p后用流式细胞仪检测，发现细胞停滞在G1期，而且细胞周期调节因子p21的表达也受影响；（2），以DNA损伤Foci以及Comet Assay（彗星实验）为检测手段，观察了siRNA敲低HeLa细胞中的Arp8或Ino80p后，对CPT处理所致的DNA损伤以及其修复情况。同时，利用DSB的HR和NHEJ两种修复GFP荧光报告细胞株进行的实验结果表明，hIno80复合物与这两种修复途径都有关联。(3)，我们发现hIno80复合物还参与了多种肿瘤发生相关因子的表达调控包括BCCIP（肿瘤抑制因子）和HIF1a（缺氧诱导因子），其相关数据分别发表在2013年的International Journal of Oncology和 Plos One上。还有，从我们前期数据中证实MCRS1是hIno80的亚基之一，而MCRS1又可以与肿瘤抑制因子P-TEN结合。进一步研究证实，MCRS1为Ino80和含hMOF的NSL复合物所共享。我们进一步对NSL复合物研究并证实了NSL复合物可以通过对组蛋白H4的乙酰基化修饰，募集MLLs复合物并增强其H3K4甲基化酶活性, 从而增强一些基因的转录水平。这部分数据发表在2013年的Plos Genetics上。.