从HeLa细胞核抽出物中纯化H2AZ置换活性组分及其生物学功能的研究

Highly folded chromatin structure is packaged by chromosomal DNA wrapped around histone octamers composed of two copies of each canonical histone H3, H4, H2A and H4. Alterations in chromatin structure play a key role in gene transcription regulation and a variety of biological processes in cells. It has been known that changes in chromatin structure are regulated in at least three different ways: by post-translational modifications of histones, by ATP-dependent remodeling of nucleosomes, and by the deposition/eviction of histone variants. Previous studies have shown that deposition/eviction of histone variant H2AZ is involved in many biological processes in cells including gene transcription regulation, chromosome segregation, and DNA damage repair. Recently, by tracking and detecting the protein fractions which has been purified from HeLa cell nuclear extracts through multi-step chromatography using in vitro H2AZ deposition enzyme activity assay system, we found the catalytic protein fractions which can catalyze the exchange between histone variant H2AZ and canonical histone H2A. Multidimensional Protein Identification (MudPIT) analysis indicated that the catalytic protein fractions are unrelated with the SRCAP complex which is published previously, suggesting a novel human histone variant H2AZ replacement enzyme. In this project, we will further identify and characterize this novel H2AZ replacement enzyme and its subunit composition, and we will also clarify its biological functions in the cells and its action mechanisms.

由DNA围绕核心组蛋白所形成的核小体，经过高度折叠形成染色质结构，而染色质结构的改变对基因的转录调控以及细胞内的多种生物过程起着至关重要的作用。目前认为，染色质结构的改变主要由具有酶活性的多亚基复合物通过组蛋白的翻译后修饰、染色质重塑以及组蛋白变体与标准组蛋白间的置换等来实现。已有研究表明，组蛋白变体H2AZ的置换在基因转录调控以及DNA损伤修复等过程中都起着重要的作用。最近，我们利用体外H2AZ置换酶活性检测系统，通过对人细胞核提取物经过多步骤分离纯化的方法，对其蛋白组分进行跟踪检测，发现了具有催化H2AZ-H2A间置换的蛋白酶活性组分，多维蛋白质谱分析结果表明，此酶活性与已发表的SRCAP酶复合物无关，提示可能为一种新的人组蛋白变体H2AZ置换酶。在本项目研究中，将进一步纯化与鉴定这一新的人组蛋白变体H2AZ置换酶的亚基分子组分，并阐明其在细胞内的生物学功能以及其作用机理。

我们在前期工作中，利用体外组蛋白变异体置换实验，从HeLa核抽出物HPLC柱层析组分中，筛选出了具有将H2AZ置换入染色质中的活性成分，并通过蛋白质多维质谱检测得到了以蛋白质A为主的一组蛋白质，也证实这种置换活性是ATP依赖的。接下来我们需要解决的关键问题是如何进一步证实所筛选出组分中是哪一种蛋白质或蛋白复合物具有H2AZ的置换活性？从蛋白质谱分析结果中我们初步判断以下两个可能性最大的蛋白组分，第一个是蛋白质A，第二个是condensing complex II。为此，我们做了如下的深入研究。.（1）尝试利用不同的纯化方法纯化蛋白质A，再做体外H2AZ置换实验，证实其置换活性。首先在293 哺乳细胞中瞬时转染Flag-Protein A表达质粒，然后用免疫沉淀法亲和纯化带有Flag标签的蛋白质A，并用Flag peptide回收纯度较高的蛋白质A。进而用纯化的蛋白质A进行了体外H2AZ置换实验，结果显示蛋白质A确实具有将H2AZ往染色质里置换的活性，而且是ATP依赖的。为鉴定该Flag蛋白质A组分中是否还有其它的蛋白质成分，已经送样本到上海新生命中科生物公司做蛋白质谱检测分析。另外，我们还用蛋白质A的pLVX shRNA感染293细胞来敲低蛋白质A，进而提取RNA送测基因表达谱以分析其相关调控靶基因信息；.（2）通过构建稳转表达带有Halo-Flag标签的condensing complex II亚基蛋白H2的293 细胞株，再用Halo融合蛋白纯化系统得到包含H2亚基的蛋白复合物组分。为了弄清所纯化的Halo-H2中的蛋白组分，我们已经送测蛋白质谱检测以明确是否含有condensing II复合物的其它亚基或蛋白质A。然后将用体外H2AZ置换实验进行活性测试；（3）关于该置换酶在基因组上分布情况及其与H2AZ分布的关系，将在接下来的实验中用Chip方法予以明确。我们目前的研究数据基本证实了蛋白质A具有将H2AZ置换入染色质的酶活性，但其生物学意义还有待于进一步深入研究。本研究内容是原创性的，在国内外该领域研究中可能将填补空白，这将对研究和弄清H2AZ这一组蛋白变异体在细胞中的作用及其调控机制具有非常重要的意义。