脑心肌炎病毒L蛋白影响Ⅰ型干扰素信号通路的探索

Encephalomycoarditis virus (EMCV) is a new important pathogen of pigs in China. The virus infection could down-regulate type I interferon (IFN) to disarm host innate immune response. The EMCV leader protein L play important role in resist in host defense systems. But its foundation in regulating native immunity has not been reported. Recently, we found that the activity of IFN-β promoter could be decreased siginfacntly in BHK21 cells transfected with plasmid expressing L protein by using luciferase assay. This proposal will study on the molecular mechanisms of EMCV L protein down-regulating type I interferon by studing associated signaling pathways and IFN-mediated JAK-STAT signaling pathway. It should be usfull to elucidate the mechanism of EMCV L protein to antagonize the type I IFN signaling pathway and evade the host innate immune system, which will provide new data about the pathogensis mechanism of EMCV in the future.

脑心肌炎病毒（EMCV）是近十年来我国猪群中新出现的又一种重要病原，能引起宿主I型干扰素（IFN）下调，从而抑制机体先天性免疫应答。前导蛋白L是EMCV重要蛋白之一，在病毒抵抗宿主防御系统中发挥着重要作用，但其在先天性免疫应答方面的作用尚无报道。我们采用Luciferase试验发现，EMCV L蛋白能够影响IFN-β启动子活性。本项目拟将进一步研究L蛋白引起机体I 型 IFN信号通路下调的分子机制；同时，从I 型 IFN发挥效应的信号通路上，尤其是JAK-STAT 信号通路来探索L蛋白如何影响I 型 IFN发挥效应，系统阐明EMCV的L蛋白影响机体I型 IFN信号通路的分子机理，丰富EMCV致病机制的理论基础。

脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）能够抑制宿主I型IFN产生，进而抑制先天性免疫应答，但发挥该作用的病毒编码蛋白及其分子机制细节尚不十分清楚。本项目成功构建EMCV所有非结构蛋白真核表达质粒，通过Luciferase试验和Western blot检测后，发现L、2C和3C蛋白均明显抑制由poly IC所介导的IFN-β启动子活性，且L与2C蛋白的抑制作用成剂量依赖方式。L蛋白方面，我们发现其与RIG-1发生特异性相互作用，但不与MDA5，MAVS或IRF3相互作用。探究EMCV-L蛋白抑制IFN-β产生的功能域时，发现RIG-1与L(30-67aa)特异性相互作用，但不与L(1-33aa)相互作用。初步确定L蛋白发挥抑制功能的区域为L(30-67aa)。2C蛋白方面，我们阐明2C蛋白能抑制MDA5、RIG I、IFN-β、MX1、ISG56、ISG15及OAS等IFN-β信号通路重要基因mRNA水平，同时2C蛋白能够抑制MDA5或RIG I所介导的IFN-β 产生，并且对MDA5激活的IFN-β 启动子活性抑制更为显著。进一步发现2C蛋白与MDA5在293A细胞中存在相互作用，通过2C突变体试验及重组病毒试验明确了2C蛋白N端第26位氨基酸（V26）在抑制IFN-β启动子的活性中起着至关重要的作用。本研究丰富了EMCV逃逸先天性免疫应答的作用机制。另采用EMCV NJ08 毒株感染性克隆质粒pCMV-rNJ08，利用PCR等方法将PCV2 ORF2基因成功引入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氨基酸之间，获得感染性重组质粒pCMV-rNJ08/Cap。将质粒转染BHK-21细胞后，拯救获得重组病毒 rNJ08/Cap。拯救病毒含有分子遗传标记。Western Blot和IFA结果显示，该重组病毒成功表达Cap蛋白。将拯救病毒rNJ08/Cap进行连续传代，生长曲线和病毒蚀斑试验结果表明各代病毒生长特性与亲本病毒基本一致。证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体，为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础。