鸡传染性法氏囊病毒VP4和VP5蛋白抑制机体I型干扰素信号通路的探索

Infections bursal disease virus (IBDV) infection could down-regulate type I interferon (IFN) to disarm host innate immune response, but the proteins of IBDV which had this function had never been studied. In this study, it was confirmed that VP4 and VP5 of IBDV could inhibit type I IFN production and signaling pathway using luciferase assay. The mechanisms of VP4 and VP5 of IBDV down-regulating type I interferon would be further studied from the RIG-I or IPS-1-mediated IFN signaling pathway, IRF3 signaling pathway, NF-κB signaling pathway. From IFN-mdediated JAK-STAT signaling pathway, the mechanism of VP4 and VP5 of IBDV affecting the effect of IFN was further explored. Therefore, the project will systematically study and elucidate the mechanism of VP4 and VP5 of IBDV inhibiting the type I IFN signaling pathway, thus it will provide new target molecules for the prevention and control of IBDV infection.

目前，研究表明鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）感染机体后能够引起机体I 型干扰素（IFN）下调从而抑制机体的先天性免疫应答，但是究竟是IBDV的哪个蛋白参与引起机体I型IFN的下调，并未做深入研究。申请人首次用Luciferase 试验等证实IBDV VP4和VP5蛋白能够下调机体I 型IFN产生的信号通路和发挥效应的信号通路。在此基础上，本项目将进一步从RIG-I 或IPS-1介导的IFN 信号通路、IRF3 信号通路、NF-κB信号通路等IFN产生的信号通路上阐明VP4和VP5蛋白引起机体I 型IFN 下调的分子机制；从IFN 发挥效应的信号通路上，尤其是JAK-STAT 信号通路来阐述IBDV VP4和VP5影响I 型IFN 发挥效应的机制。由此，本项目将系统地阐明IBDV的VP4和VP5蛋白影响机体I 型IFN 信号通路的分子机理，为预防和控制IBDV感染提供新的靶向分子。

本研究将构建IBDV各病毒蛋白基因的真核表达载体，与报告质粒共转染Vero细胞，运用研究I型IFN信号通路的经典方法荧光素酶试验，研究IBDV的VP4和VP5蛋白对RIG-I介导的信号通路、IRF3、NF-κB(Nuclear factor kappa B)等IFN产生或者发挥效应的信号通路，尤其是JAK-STAT信号通路的影响。为研究IBDV的感染和发病机制，为预防和控制IBDV感染提供新的靶向分子提供依据。. 首先构建出各基因的真核表达载体pCI-CV03VP1、pCI-CV03VP2、pCI-CV03VP3、pCI-CV03VP4、pCI-CV03VP5及pCI-B87VP4和pCI-B87VP5。双酶切、Western-blotting和IFA检测证明了所构建的真核表达载体具有较好表达能力。. 再将构建的IBDV真核表达载体，与pIFN-β-Luc报告质粒共转染Vero细胞，转染poly(I:C)进行刺激，发现IBDV的VP4蛋白和非结构蛋白VP5能够明显降低IFN-β启动子的活性，从而明显降低IFN的产生，而VP1、VP2和VP3的作用相对较弱。发现两株病毒的VP4和VP5蛋白能够明显抑制RIG-I介导IFN信号通路的活性。进一步将报告质粒p4xIRF3-Luc和pNF-κB-Luc与两株病毒的VP4和VP5蛋白基因的真核表达载体共转染Vero细胞，发现，VP4和VP5蛋白能够明显抑制IRF3启动子的活性，同时对NF-κB的表达产生明显的促进作用。因此，IBDV的VP4和VP5蛋白是通过IRF3信号通路抑制机体I型IFN的表达。将构建的ISRE的报告质粒pISRE-Luc与表达病毒蛋白VP4和VP5的真核表达载体共转染，结果表明，IBDV VP4和VP5蛋白对Jak-Stat通路的信号转导产生明显的抑制作用。. 最后用Western-blot方法检测细胞中模式识别受体及下游转录因子的表达，用荧光定量PCR检测细胞因子及抗病毒基因的表达。结果显示VP4蛋白对RIG-I受体的表达有一定的抑制作用，但却刺激了TLR3的表达；VP5基因对TLR3的表达有明显的抑制作用。也影响下游转录因子、炎性细胞因子以及抗病毒基因的表达出现相应的变化。说明VP5蛋白在IBDV引起的免疫抑制中起关键作用，VP4次之。