Ckγ-ECS维持PLT2促进旱区植物柠条根系生长的功能解析

Root is a vital organ in perceiving and reacting to soil drought condition in plants. Glutathione, a small molecular compound, is known to play a key role in regulation of root cell growth and drought tolerance but underlying regulatory mechanism remains obscure. Given that γ-glutamylcysteine synthetase (γ-ECS) regulates glutathione synthesis, and PLETHORA2(PLT2) is a key gene regulating root growth and development, understanding the relation between Ckγ-ECS expression and glutathionylation of PLT2 would help elucidate the mechanism underlying glutathione-mediated regulation of root growth, expansion and drought tolerance. In this work, we will analyze the effects of drought treatments on the morphology, anatomical structure and drought resistance of the roots of Caragana korshinskii, as well as expression of Ckγ-ECS. We will also investigate the relation between the glutathionylation of PLT2 and Ckγ-ECS expression in the treated plants. Finally, we will over-express the Ckγ-ECS gene in Arabidopsis thaliana to validate its role in the promotion of glutathionylation of PLT2, the regulation of root growth and the enhancement of drought tolerance. The aim of this work is to understand the molecular mechanism underlying root regulation and drought tolerance, which could be applicable for the improvement of drought tolerances in plants grown and cultivated in arid and semi-arid areas.

根系是植物感知和抵御土壤干旱的重要器官。谷胱甘肽是植物体内一类重要的小分子化合物，在植物根系生长和伸长中起重要作用，但其调控根生长和伸长的作用机制还不清楚。研究Ckγ-ECS调控的谷胱甘肽合成是否诱导根尖分生组织干细胞维持关键转录因子PLETHORA2(PLT2)蛋白的谷胱甘肽化并促进柠条根系发育将有助于解析上述机制。本项目以旱区植物柠条锦鸡儿为材料，以PLT2的谷胱甘肽化分析为切入点，分析干旱和抑制剂处理对柠条根系形态和解剖结构以及抗旱性的影响揭示谷胱甘肽合成关键酶γ-ECS在调控根干细胞维持相关蛋白的谷胱甘肽化进而促进柠条根系生长和抗旱性提高中的作用。最后在模式植物拟南芥中过表达Ckγ-ECS基因进一步验证和分析其调控PLT2谷胱甘肽化促进根系生长提高抗旱性的作用。以期阐明柠条深根性状形成的分子机制，进而利用其优质的抗性资源，在干旱半干旱区植被恢复和森林培育中发挥重要作用。

柠条锦鸡儿是一种抗旱性极强的灌木，在水土保持和防风固沙中起重要作用，发达的根系是柠条抗旱保水的主要原因之一。然而，对柠条形成发达根系的调控机制一直不清楚。项目针对Ckγ-ECS调控的谷胱甘肽合成影响根尖分生组织干细胞维持关键因子PLETHORA2(PLT2)蛋白功能，促进柠条根系发育和抗旱性提高的机制开展研究。主要研究结果如下：（1）利用PEG6000模拟干旱处理，发现轻度干旱胁迫可以导致根系细胞数目增多、且细胞排列更加紧密，促进柠条根系生长，重度干旱则抑制根系生长。激光共聚焦观察表明GSH主要分布在柠条根尖分生组织，干旱胁迫诱导后Ckγ-ECS基因表达量升高、酶活性增强，GSH合成增加；抑制根系中GSH的合成，会导致柠条根尖细胞排列紊乱、松散，根系生长被抑制，抗旱性减弱。（2）克隆CkPLT2基因，构建原核表达载体，纯化CkPLT2蛋白并制备单克隆抗体。干旱胁迫处理能够诱导柠条根系中CkPLT2蛋白的表达，从而影响柠条植株的抗旱性。对PLT2下游应答基因的表达分析表明干旱胁迫条件下柠条根系的生长与生长素依赖的PLT途径密切相关。谷胱甘肽化抑制剂处理后Ckγ-ECS基因和CkPLT2基因的表达量下降，柠条幼苗主根及地上部生长均受到明显抑制，蛋白谷胱甘肽化可以通过影响Ckγ-ECS基因、CkPLT2基因的表达，调控柠条植株的生长和抗旱性。（3）利用IP实验分析表明，PLT2可以与GSH的互作，但是用原核表达蛋白未能检测到PLT2蛋白的谷胱甘肽化，酵母双杂交实验也未能证明PLT2与GST6之间的互作。根尖蛋白氧化还原修饰组分析发现干旱胁迫处理下富集的差异修饰蛋白主要是在蛋白水解正调控方面。（4）过表达柠条Ckγ-ECS 基因发现干旱胁迫条件下，转基因植株主根明显长于野生型。细胞学观察表明转基因拟南芥根尖分生区较长，细胞数量更多，而细胞较小且排列紧密。转基因植株叶片气孔密度减少，叶片保水力更强，干旱胁迫条件下的叶片相对含水量更高。说明Ckγ-ECS可以影响地上部和地下部形态的发育，增加根冠比，提高植株的抗旱性。