长链非编码RNA H19在西妥昔单抗治疗结直肠癌耐药中的作用及机制研究

Cetuximab is one of the best drugs for metastatic colorectal cancer (mCRC). However, drug resistance is very severe and the precise mechanisms are far from fully elucidated. We compared gene expression of the liver biopsy from CRC patients with or without ceteximab treatment. Our preliminary data revealed that the long non-coding RNA H19 and RET gene were significantly increased after cetuximab resistance in KRAS and BRAF wild-type lesions, suggesting H19 and RET are involved in cetuximab resistance. Further bioinformatic analysis showed that H19 may be ceRNA of RET by acting on miR-196b-5p and thus regulate cetuximab secondary resistance. Therefore, we hypothesize that H19 may be one of the key factors on cetuximab resistance. In this project, KRAS, BRAF, NRAS and PIK3CA wild-type colon cancer cell lines DiFi and Lim1215 will be used to investigate whether H19 takes part in regulating cetuximab resistance. Cetuximab resistant cell lines DiFi-R and Lim1215-R, as well as transplantation tumor nude mouse model will be constructed or established. H19 expression will be verified in both tissue and plasma samples from a cohort of clinical data as well as sample database of mCRC. Finally, it will evaluate that whether H19 expression could be one of the markers of primary drug resistance and whether inhibition of H19 could reverse cetuximab resistance of mCRC. In conclusion, the successful fulfill of this project will help to further understand the effect and mechanism of long non-coding RNA H19 on cetuximab resistance and provide the guide for drugs to reverse mCRC resistance.

西妥昔单抗是转移性结直肠癌最佳治疗抗体之一，但耐药机制不明。本项目组前期对结直肠癌肝转移患者西妥昔单抗治疗前和肿瘤进展后的肝活检组织样本进行了高通量测序，发现在KRAS、BRAF野生型病灶中，长链非编码RNA H19及RET基因在耐药后上调最显著，提示H19及RET均参与耐药；生物信息学分析发现，H19可能通过miR-196b-5p作为RET的ceRNA实现对RET的调控，从而导致耐药。基于以上研究，我们提出“H19是西妥昔单抗耐药的一个关键因素”的科学问题。本项目拟选取KRAS、BRAF、NRAS及PIK3CA 野生型结肠癌细胞，筛选耐药细胞株，构建移植瘤裸鼠模型，探讨H19参与耐药的机制；利用我科已建立的转移性结直肠癌患者队列及样本资源库，明确H19在肝活检组织和血浆样本中的表达，筛选耐药标志物。本项目的开展将有助于阐明H19在西妥昔单抗耐药中的机制，并为转移性结直肠癌的治疗提供依据。

西妥昔单抗是临床上治疗转移性结直肠癌的有效药物之一，但耐药形势严峻，机制不明。本课题组前期在结直肠癌患者西妥昔单抗治疗前后的组织活检样本高通量测序中发现，H19及RET基因耐药后显著上调。鉴于H19被报道与多种肿瘤发展密切相关，我们对H19在西妥昔单抗耐药中的机制进行了深入探讨。. 通过研究，本课题获得三方面实验成果。细胞水平：采用不同浓度西妥昔单抗处理结直肠癌细胞株，构建耐药细胞株Lim1215-R，为研究提供良好的细胞模型；通过检测敏感组与耐药组H19和RET表达水平及西妥昔单抗处理后的细胞活力和侵袭能力，验证H19与RET基因升高参与了耐药的发生。再通过对H19过表达或敲低，研究H19变化对结直肠癌细胞及其耐药的影响，结果显示：耐药细胞株H19敲减表达水平后，细胞增殖活性降低，RET的表达也随之降低；而对野生型细胞株过表达H19后，细胞对西妥昔单抗的敏感性降低，细胞增殖活力升高。双荧光素酶实验验证H19和RET结合，明确了H19能通过结合RET影响细胞耐药。动物水平：制备H19干扰慢病毒，感染Lim1215细胞，构建裸鼠荷瘤模型，并用西妥昔单抗给药处理，观察肿瘤生长情况，结果发现移植敲低表达H19的结直肠癌细胞且注射西妥昔单抗的荷瘤小鼠，其肿瘤生长被显著抑制，药物治疗效果好且RET基因的表达随之降低。临床组织水平：利用我科已建立的样本资源库中结直肠癌患者用药前和耐药后的活检组织样本，比较RET的表达，结果显示RET在耐药患者组织中的水平显著高于治疗前，进一步验证了H19调节RET在耐药中的作用机制。. 本项目阐明了H19在西妥昔单抗耐药中的作用机制，为转移性结直肠癌的治疗提供新的靶点与依据，以H19为分子靶点的干预策略将有望优化结直肠癌的诊疗方案并成为一种逆转耐药的治疗方向。课题基本按照计划顺利完成，依托本课题的支持，目前已发表2篇SCI论著、1篇中文综述。